5.3 miRNA-vermittelte Regulation von Targets
Innerhalb des RISC interagiert miRNA mit Zielgenen über Basenpaarung. Die Interaktion zwischen einer miRNA und ihrer Ziel-mRNA ist auf das 5′-Ende der miRNA beschränkt. Die Sequenzkomplementarität zwischen den Nukleotiden 2-8, auch als „Seed-Region“ bekannt, ist für die Erkennung der Zielsequenz von entscheidender Bedeutung , obwohl Ausnahmen von dieser Regel nachgewiesen wurden . Am häufigsten sind miRNA-Bindungsstellen in der 3′-untranslatierten Region (UTR) von Ziel-mRNAs vorhanden, normalerweise in mehreren Kopien . Es wurde jedoch auch gezeigt, dass miRNA auf die 5′-UTR und codierende Regionen von mRNA abzielt . Eine Studie von Tay et al. demonstriert, dass ein Netzwerk von miRNA an mehrere Stellen innerhalb der Codierung und 3′-UTR eines einzelnen mRNA-Ziels binden kann, was die Komplexität der miRNA-vermittelten Zielregulation erhöht . Der Grad der Komplementarität zwischen der Samenregion der miRNA und der Bindungsstelle in der Ziel-mRNA bestimmt den Mechanismus, durch den die miRNA das Ziel reguliert . Wenn die miRNA eine ausreichende Sequenzkomplementarität (nahezu perfekt) zur Ziel-mRNA aufweist, erfolgt die Regulation durch einen Prozess, der als RNA-Interferenz bezeichnet wird, wobei der RISC darauf gerichtet ist, die Ziel-mRNA zu spalten . Bei ungenügender Komplementarität, was bei Säugetieren im Allgemeinen der Fall ist, wird die Regulation durch Repression der Translation und/oder Destabilisierung der mRNA erreicht.
Die Kernkomponenten des RISC sind die Argonaute (Ago) -Familie von Proteinen, die eine Schlüsselrolle in seiner Funktion spielen . Alle vier Ago-Proteine von Säugetieren (Ago1-Ago4) können die translationale Repression einer Ziel-mRNA steuern, jedoch besitzt nur Ago2 eine „Slicer“ -Aktivität und ist für die Spaltung der Ziel-mRNA verantwortlich . Der genaue Mechanismus der miRNA-vermittelten translationalen Repression von Zielgenen ist noch ungewiss . Mehrere Studien haben gezeigt, dass translationale Repression vor Beginn der Translation auftritt . Andere Studien deuten jedoch darauf hin, dass die Repression nach Beginn der Translation auftritt . Es wurde zunächst angenommen, dass sich die miRNA-vermittelte Repression von Zielgenen überwiegend auf Proteinebene widerspiegelte, ohne oder mit minimaler Wirkung auf die mRNA-Spiegel. Es wurde nun jedoch gezeigt, dass die miRNA-vermittelte Repression von Zielgenen häufig mit der Destabilisierung von mRNA assoziiert ist, obwohl nicht bekannt ist, ob dies ein sekundärer Effekt der translationalen Repression ist. Der miRNA-vermittelte Abbau von mRNA-Targets beinhaltet die Deadenylierung (Entfernung des Poly-A-Schwanzes), gefolgt von Decapping und exonukleolytischem Digestion . Darüber hinaus wird angenommen, dass Verarbeitungskörper (P-Körper), zytoplasmatische Strukturen, die an der Speicherung und dem Abbau von mRNA beteiligt sind, eine Rolle bei der miRNA-Regulation spielen . Es wird angenommen, dass miRNA die Ziel-mRNA und die zugehörigen RISC-Proteine zu diesen Speicherstrukturen führt, die für den mRNA-Abbau und translationale Repressionsfaktoren angereichert sind . Die Mechanismen, die bestimmen, ob eine Ziel-mRNA dem Abbau- oder dem translationalen Repressionsweg folgt, sind derzeit unbekannt. Zur Komplexität der miRNA-vermittelten Regulation tragen die jüngsten Entdeckungen bei, dass die miRNA-induzierte Repression von Zielen unter verschiedenen Stressbedingungen rückgängig gemacht werden kann und dass miRNA die Translation von Ziel-mRNA aktivieren kann .
Die miRNA-vermittelte Regulation scheint ein äußerst dynamischer Prozess zu sein, dessen Komplexität dadurch erhöht wird, dass für die Regulation keine perfekte Komplementarität zum Ziel erforderlich ist. Dies deutet darauf hin, dass eine einzelne miRNA das Potenzial hat, mehrere Zielgene zu regulieren. Darüber hinaus kann ein Netzwerk von miRNA gleichzeitig funktionieren, um eine einzelne mRNA zu regulieren. Dies erschwert letztendlich die In-Silico-Identifizierung von Zielgenen und die Aufklärung der miRNA-Funktion erheblich.
Die Seed-Region, die sich an den Positionen 2-7 vom 5′-Ende der miRNA befindet, wird von der RISC als Nukleationssignal zur Erkennung von Ziel-mRNA verwendet. Auf der mRNA werden die entsprechenden Stellen als „Seedstellen“ bezeichnet. Es gibt eine Reihe von Stringenzen, die mit der Erkennung und Bindung von Ziel-Seed-Sites verbunden sind . Eine strenge Saatgutstelle hat eine perfekte Watson-Crick-Bindung und kann in vier „Saatgut“ -Typen unterteilt werden: 8mer, 7mer-m8, 7mer-A1 und 6mer . Jeder dieser Typen unterscheidet sich in Abhängigkeit von der Kombination des Nukleotids der Position 1 und der Paarung an Position 8. 8mer weist sowohl ein Adenin an Position 1 der mRNA-Zielstelle als auch eine Basenpaarung an Position 8 auf. Es ist bekannt, dass ein Adenin an der Zielstelle, die der Position 1 einer miRNA entspricht, die Effizienz der Zielerkennung erhöht. 7mer-A1 hat nur an Position 1 ein Adenin, während 7mer-m8 nur an Position 8 eine Basenpaarung aufweist. Im Gegensatz dazu hat 6mer weder ein Adenin an Position 1 noch eine Basenpaarung an Position 8 .
Neben der stringenten Seed-Erkennung ist auch eine mäßig stringente Erkennung möglich, da der RISC kleine Mismatches oder Wackelpaarungen innerhalb der Seed-Region tolerieren kann. Die thermodynamische Stabilität einer Wobble-Paarung (wie G: U) ist vergleichbar mit der einer Watson–Crick-Paarung .
Es ist bekannt, dass die Watson–Crick-Paarung im 3′-Teil des miRNA-Moleküls die Wirksamkeit der Ortserkennung bei miRNA-Zielen mit Samenpaarung verbessert . Die bevorzugte Nukleotidzahl der Übereinstimmungen im 3′-Teil unterscheidet sich zwischen der Stelle, die eine stringente Samenpaarung aufweist, und der Stelle, die eine moderate stringente Samenpaarung aufweist . Stringente Samen erfordern 3-4 Übereinstimmungen in den Positionen 13-16, während moderate stringente Samen 4-5 Übereinstimmungen in den Positionen 13-19 erfordern. Standorte mit dieser zusätzlichen 3′-Paarung werden als 3-ergänzende und 3′ kompensatorische Standorte bezeichnet .
Es wurde ausführlich gezeigt, dass die überwiegende Mehrheit der miRNA-Zielerkennungssequenzen in der 3′-UTR des Zielgens gefunden wird, obwohl miRNA-beladenes RISC theoretisch jedes Segment von mRNA binden kann. Zielgene haben im Allgemeinen eine längere 3’UTR, während bestimmte ubiquitäre Gene, wie z. B. Hausgene, dazu neigen, eine kurze 3’UTR zu haben, um möglicherweise zu vermeiden, dass sie von miRNA reguliert werden . Zielstellen sind mit 3’UTR nicht gleichmäßig verteilt. Sie befinden sich in der Nähe beider Enden auf langen 3’UTR (in der Regel ≥2000 nt). Für kürzere 3’UTR sind Zielstellen in der Regel ~ 15-20 nt vom Stop-Codon entfernt.
Während allgemein angenommen wird, dass funktionelle miRNA-Stellen bevorzugt in 3’UTR lokalisiert sind, können Seed-Stellen in der kodierenden Sequenz und 5′ UTR-Regionen auch die mRNA-Herunterregulierung fördern . Die Grundlage für die bevorzugte miRNA-Bindung in der 3′ UTR kann eine Reihe von Erklärungen haben. Beispielsweise muss der RISC möglicherweise mit anderen Proteinkomplexen wie Ribosomen konkurrieren, die an die kodierende Sequenz und Translationsinitiationskomplexe in der 5’UTR binden. Als solches könnte die 3’UTR für eine langfristige Bindung einfach zugänglicher sein als die beiden anderen Standorte .