Pepckin tehostunut ilmentyminen mRNA
PEPCKIN sytosolinen muoto on sekä maksan että munuaisten glukoneogeneesin ensisijainen säätelypaikka (71). Allosteeriset mekanismit tai kovalenttiset modifikaatiot eivät kuitenkaan säätele tätä aktiivisuutta. Sen sijaan sitä säännellään yksinomaan mekanismeilla, jotka määrittävät PEPCK-mRNA: n tason ja siten valvovat PEPCK-proteiinin tasoa. Tämä tapahtuu muuttamalla joko synteesinopeutta tai pepckin mRNA: n hajoamisnopeutta. Sytosolipepckiä koodaava PCK1-geeni koostuu 10 eksonista ja 9 intronista ja on pituudeltaan noin 6 kb (13). Se koodaa yhden 2,6 kb mRNA: n, joka muuntuu proteiiniksi, joka sisältää 621 aminohappoa ja jonka massa on 69 300 Da. PEPCK: n mRNA-pitoisuus rotan munuaisissa nousee nopeasti akuutin asidoosin (80) alkamisen jälkeen. Korotus aloitetaan 1 tunnin kuluessa ja se saavuttaa maksimissaan 7 tunnin kuluessa tason, joka on kuusinkertainen normaaliin verrattuna. Transkriptio run off-kokeet (80) osoittivat, että muutokset pck1-geenin transkription suhteellisessa nopeudessa selittävät PEPCK mRNA: n induktion. Lisäksi PEPCK: n mRNA-pitoisuuksissa havaitut muutokset korreloivat läheisesti aikaisempien tietojen kanssa, joissa mitattiin PEPCK-proteiinisynteesin suhteellisten nopeuksien muutoksia terveillä ja asidoottisilla rotilla (84). PEPCK: n mRNA: n kuusinkertainen indusoitu taso säilyy kuitenkin rotilla, jotka ovat kroonisesti asidoottisia, vaikka transkription suhteellinen määrä vähitellen vähenee ja tasaantuu tasolle, joka on vain kaksinkertainen verrattuna normaaleilla rotilla havaittuun tasoon (81).
PEPCK-promoottorin eri segmenttejä sekä ydinpromoottoria (-460 – +73 bp), joka sisältää spesifisiä mutaatioita säätelyaineissa, on analysoitu laajasti siirtogeenisillä eläimillä niiden roolin määrittämiseksi PCK1-geenin ilmentymisen kontrolloinnissa (72). Naudan kasvuhormoniin (bGH) fuusioitu villityyppinen ydinpromoottori sisältää kaikki tarvittavat tiedot asianmukaisen ilmentymisen ja hormonaalisen säätelyn varmistamiseksi maksassa. PEPCK-promoottorin suurempi 2,3 kb: n segmentti tarvittiin transgeenin ilmentymiseen rasvakudoksessa. Molemmat konstruktiot ilmenivät kuitenkin pieninä pitoisuuksina munuaisissa. Sen sijaan crc362-transgeeni, joka sisältää promoottorin vain 362 bp, mutta rotan pck1-geenin kaikki alajuoksun eksonit ja intronit ilmaistiin normaaleina pitoisuuksina munuaisissa (40). Tämä transgeeni erosi endogeenisesta geenistä vain siten, että kananpojan pck1-geenin osa korvautui PEPCKIN mRNA: n 3′ – UTR: ää koodaavalla lopullisella eksonilla. Lisäksi viimeksi mainittu konstruktio indusoi munuaisten toimintaa merkittävästi, kun siirtogeenisistä hiiristä tehtiin asidoottisia (20).
LLC-PK1-F+ – soluissa esiintyy pH-reagoiva pepck-mRNA: n induktio (64). Aiemmat yritykset tunnistaa pH-reagoiva Elementti ohimenevän ilmentymisen eri PEPCK-kloramfenikoli asetyylitransferaasi reporter konstructs LLC-PK1-F + solut tuottivat ristiriitaisia tuloksia (21, 77). Nämä tutkimukset osoittivat kuitenkin selvästi, että HNF-1:n sitoutuminen P2-alkuaineeseen on välttämätöntä munuaisten PEPCK-entsyymin perusekspressiolle ja että tämä proteiini: DNA-vuorovaikutus voi lisätä ilmentymistä asidoosin aikana. Luciferaasikonstruktiot, jotka sisältävät joko 490 tai 2300 bp PEPCK-promoottoria, aktivoituvat voimakkaasti LLC-PK1-F+ – solujen kotransfektiolla proteiinikinaasi A: n (112) katalyyttisellä alayksiköllä. Kummassakaan konstruktiossa ei kuitenkaan esiinny lisääntynyttä aktiivisuutta, kun transfektoidut solut siirrettiin happamaan väliaineeseen (pH 6,9, 10 mM HCO-3) (Wall Q et al., julkaisemattomat tiedot, 1999). Tämä havainto ja havainto, että transgeeni, jossa on vain 362 bp promoottoria sekä alajuoksun eksonit ja intronit, riittää palauttamaan pH-responsiivisen induktion (20), viittaavat siihen, että PEPCK-geeni saattaa sisältää alajuoksun alkuainetta, joka on välttämätön pH-responsiivisen transkription lisääntymisen kannalta. Muissa kokeissa on todettu, että C / EBPß (112) ja ATF-2 (44) sitoutuvat munuaisten PEPCK-geenin CRE-1-elementtiin.
aiemmat tutkimukset ovat myös osoittaneet, että PEPCK-mRNA: n puoliintumisaika pitenee maksassa cAMP-vasteen (76) ja glukokortikoidien (132) ansiosta. Stabiilisuuden lisääntyminen voi myös edistää munuaisten PEPCK-mRNA: n jatkuvaa induktiota kroonisen asidoosin aikana (81). Siksi selektiivisellä mRNA-stabiloinnilla voi olla myös tärkeä rooli PEPCK-geenin ilmentymisen fysiologisessa säätelyssä. Tetrasykliinille reagoivaa promoottorijärjestelmää käytettiin erilaisten kimeeristen β-globiini-PEPCK (ßG-PCK)-mrnojen puoliintumisajan määrittämiseen LLC-PK1-F+ – soluissa (67).
ßG-PCK-1 mRNA, joka sisältää PEPCK-mRNA: n Koko 3′ – UTR: n, hajosi puoliintumisajan ollessa 1, 2 tuntia. RNaasi H-hoito osoitti, että nopea deadenylaatio tapahtui samanaikaisesti ßG-PCK-1 mRNA: n hajoamisen kanssa. Aiemmat tutkimukset (108) osoittivat, että PCK-7, 50-nt-segmentti 3′-UTR: n päässä, sitoo tunnistamatonta proteiinia, joka voi edistää PEPCK-mRNA: n nopeaa hajoamista. Kimeerisen ßG-PCK-7 mRNA: n puoliintumisaika on kuitenkin 17 tuntia. Viereisen PCK-6-segmentin, 23 bp AU: n rikkaan alueen, liittäminen mukaan tuotti ßG-PCK-6/7 mRNA: n, jonka puoliintumisaika on 3,6 tuntia. ßG-PCK-3 mRNA, joka sisältää 3′-puolikkaan 3′-UTR: stä, hajosi samalla puoliintumisajalla. Yllättäen myös ßG-PCK-2 mRNA, jossa on 5′-loppu 3′ – UTR, hajosi nopeasti (t1/2 = 5,4 tuntia). RNA-geelisiirtoanalyysit osoittivat, että AUF1 sitoutuu PCK-7 -, PCK-6-ja PCK-2-segmentteihin, joilla on suuri affiniteetti ja spesifisyys. Mutaatioanalyysi osoittaa, että AUF1 sitoutuu PCK-6: n UUUUAU-sekvenssiin ja PCK-7: n runkosilmukkarakenteeseen ja viereiseen CU-alueeseen. Siten AUF1 sitoutuu useisiin epävakauttaviin elementteihin 3′ -UTR: n sisällä, jotka osallistuvat PEPCK mRNA: n nopeaan vaihtumiseen. Uudemmat kokeet osoittavat, että PCK-7-segmentti sitoo myös ζ-kristalliinia/NADPH: kinonireduktaasia, jolla on suuri affiniteetti ja spesifisyys (Hajarnis and Curthoys, unpublished data, 2006). Näin ollen sama mekanismi, joka selittää GA: n ja GDH: n mRNAs: n asteittaisemman induktion, voi myös vaikuttaa PEPCK: n mRNA-tasojen jatkuvaan nousuun kroonisen asidoosin aikana.