Molecular Expressions Microscopy Primer: Specialized Microscopy Techniques-Fluorescence Digital Image Gallery-Madin-Darby Canine Kidney epiteelisolut (MDCK)

S. H. Madinin ja N. B. Darbyn kehittämä mdck-solulinja sai alkunsa aikuisen cockerspanielin munuaiskudoksesta syyskuussa 1958. Siitä lähtien soluja on hyödynnetty laajalti beeta-amyloidin esiasteproteiinin käsittelyn sekä sen proteolyyttisten tuotteiden lajittelun tutkimiseen.

mdck-solulinjan morfologia on epiteeli, ja solut ovat immunoperoksidaasivärjäyksellä positiivisia keratiinille. Virukset, jotka MDCK-solut ovat alttiita ovat vesicular stomatitis (Indiana kanta), vaccinia, coxsackievirus B5, reovirus 2 ja 3, adenovirus 4 ja 5, vesicular exanthema sian, ja tarttuva koiran hepatiitti. Solut ovat resistenttejä coxsackievirus B3: lle ja B4: lle sekä poliovirus 2: lle, ja ne ovat negatiivisia käänteiskopioijaentsyymille.

mdck-linjaa käytetään yleisesti yleismallina epiteelisoluille, jotka muodostavat epiteeliksi kutsutun kudostyypin. Pääasiassa löytyy kattavat sisäelimet ja muut pinnat kehon, epiteeli koostuu tiiviisti pakattuja soluja, jotka on järjestetty arkkia. Nämä solut erittävät solunulkoista matriisia nimeltä tyvi-lamina tyvessään, joka auttaa ankkuroimaan epiteelikudoksen viereisiin kudoksiin. Epiteelisoluilla ei myöskään ole suoraa pääsyä verisuoniin, joten niiden on saatava happea ja ravinteita diffuusion kautta, samalla tavalla kuin niiden on pakko päästä eroon aineenvaihduntatuotteista. Ihosolut toimivat eri mekanismeissa, mukaan lukien suojaus, imeytyminen, aistien vastaanotto ja eritys. Munuaisten epiteelisoluilla on keskeinen rooli eritysmateriaalien väliaikaisessa varastoinnissa ja myöhemmässä erityksessä.

yllä olevassa digitaalisessa kuvassa esitetty Madin-Darby-koiran munuaisviljelmä oli merkitty falloidiiniin konjugoidulla dapilla ja Alexa Fluor 568: lla, jotka kohdistavat DNA: n solun tumaan ja F-aktiinin sytoskeletaaliseen verkkoon. Lisäksi soluihin transfektoitiin pEYFP-mitokondrio (tehostettu keltainen fluoresoiva proteiini) – kimeerisellä plasmidilla solunsisäistä lokalisointivektoria. Kuvat tallennettiin harmaasävyssä Qimaging Retiga Fast-EXi-kamerajärjestelmällä, joka oli kytketty Olympus BX-51-mikroskooppiin, joka oli varustettu Omega Optical-yhtiön tarjoamilla kaistanpäästöfluoresenssisuodattimen optisilla lohkoilla. Prosessointivaiheessa yksittäiset kuvakanavat pseudoväritettiin RGB-arvoilla, jotka vastaavat kutakin fluoriforiemissiospektriprofiilia.

MDCK epiteelisolut MitoTracker Red CMXRos, Alexa Fluor 488, ja DAPI – adherent kulttuuri Madin-Darby koiran munuaissolujen merkittiin solunsisäisen mitokondrion verkon ja filamentous aktiinin MitoTracker Red CMXRos ja Alexa Fluor 488 konjugoitu falloidiini, vastaavasti. Ultraviolettia imevää luotainta dapia käytettiin DNA: n vastapainona.

peroksisomien ja Klatriiniproteiinien kohdistaminen Madin-Darbyn munuaissoluissa immunofluoresenssilla – tässä jaksossa mdck-solujen esitellyssä viljelmässä immunofluoresenssimerkittiin primaarisilla anti-klatriinilla (raskasketju) hiiren monoklonaalisilla vasta-aineilla, joita seurasivat vuohen anti-hiiren Fab-fragmentit konjugoituneina syaniiniväriaine Cy3: een sytoskeletaaliseen verkkoon kohdistamiseksi. Lisäksi viljelmässä esiintyvät peroksisomit merkittiin immunofluoresenssisesti sy2: lla, joka on konjugoitu vuohien sekundaarisiin vasta-aineisiin, jotka kohdistuvat kanin anti-PMP 70 (peroksisomaalinen kalvoproteiini 70) primaarisiin vasta-aineisiin. Ytimet vastattiin Hoechst 33342: lla.

Enhanced Yellow Protein Subcellular Localization of mitokondriot in mdck Cell Cultures – a culture of Madin-Darby canine kidnapply epiteelisolujen was transfected with a pEYFP-mitokondriot (enhanced yellow fluorescent protein) chimeric plasmid subcellular localization vector. Solut värjättiin myös SYTOX Orangella ja Alexa Fluor 350: llä, jotka oli konjugoitu falloidiiniin, kohdistaen DNA: han ja sytoskeletaalinen filamenttinen aktiiniverkko vastaavasti.

immunofluoresenssi histonien ja Golgi-kompleksin kohdentaminen Koiran munuaisten Epiteelisoluviljelmissä-Madin-Darby koiran munuaissolut kiinnitettiin paraformaldehydillä, permeabiloitiin ja käsiteltiin kanin (Anti-giantin) ja hiiren (anti-histonit; pan) primaaristen vasta-aineiden seoksella, minkä jälkeen sekundaariset vasta-aineet konjugoitiin Alexa fluori 488: aan ja Texas Rediin. Toissijaisessa vasta-ainecocktailissa oli myös falloidiiniin konjugoitu Alexa Fluor 350, joka oli suunniteltu kohdistamaan samanaikaisesti filamenttiseen aktiiniverkkoon.

Madin-Darby-Koiran munuaissoluissa esiintyvien Ydinhuokoskompleksiproteiinien kaksinkertainen immunofluoresenssi ja tiiviit liitokset-epiteelisolujen tiiviit liitokset ja ydinhuokoskompleksiproteiinit kuvattiin samanaikaisesti mdck-soluissa hiiren anti-npcp: n ja kanin anti-ZO-3: n primaaristen vasta-aineiden cocktaililla, minkä jälkeen vuohien anti-hiiri-ja anti-kani-sekundaariset vasta-aineet konjugoituivat vastaavasti Alexa Fluor 488: aan ja Alexa Fluor 568: aan.

Mdck-solujen Mitokondrioverkosto-Madin-Darby-koiran munuaissolujen kiinnittynyt yksikerroksinen viljelmä merkittiin immunofluoresenssilla hiiren primaarisilla anti-oxphos-kompleksilla V inhibiittoriproteiinivasta-aineilla ja sen jälkeen vuohen anti-hiiren Fab-fragmenteilla, jotka on konjugoitu fluoreseiiniin. Kulttuuri värjättiin myöhemmin falloidiniin konjugoidulla Alexa Fluor 568: lla, joka paljasti yksityiskohtia rihmamaisesta aktiiniverkostosta, ja dapilla DNA: sta tumassa.

Mdck-solut, joissa on vehnänalkioita agglutiniini-lektiinejä, ovat erikoistunut kasviproteiinien luokka, joka sitoutuu tiettyihin proteiineihin kiinnittyneisiin tai solukalvoissa asuviin hiilihydraattiryhmiin. Merkittävä tämän ryhmän jäsen, vehnänalkio agglutiniinia käytetään usein Golgi-kompleksin paikallistamiseen fluoresenssimerkintäkokeissa. Tässä jaksossa kuvattu kulttuuri oli merkitty Vehnänalkioagglutiniinilla konjugoituna Texas Rediin, sekä falloidiniin ja dapiin konjugoidulla Alexa Fluor 488: lla (kohdistaen DNA: ta tumaan).

mitokondrioiden kohdentaminen fluoresoivilla proteiineilla Koiran munuaissoluviljelmissä-mdck-solujen semi-confluentiviljelmä transfektoitiin ohimenevästi plasmidikimeralla, joka sisälsi koodausjakson tehostetulle keltaiselle fluoresoivalle proteiinille (EYFP), joka fuusioitui mitokondrioiden kohdistusjaksoon ihmisen sytokromi C-oksidaasin VIII alayksiköstä. Kiinnittymisen ja permeabilisaation jälkeen solut torjuttiin filamenttiaktiinille falloidiiniin konjugoidulla Alexa Fluor 546: lla ja DNA: lle ydinspesifisellä Dapi-väriaineella.

Tight Junctions in Madin-Darby Canine Kidney Cell Cultures-the tight junction protein ZO-3 was visualized by immunofluoresence in a confluent cell Vulture of MDCK cells. Kanin anti-ZO-3-vasta-aineet, jotka kohdistivat proteiiniin, merkittiin vuohi-Anti-kanin sekundaarisilla Fab-fragmenteilla, jotka on konjugoitu syaniiniväriin, Cy3: een. Tumien vastapainona käytettiin DNA-spesifistä fluoriforidapia.

Mdck: n kiinnittyneet soluviljelmät Texas Redin, Alexa Fluor 488: n ja Alexa Fluor 350: n kanssa – kaksois-immunofluoresenssimerkintäkokeessa mdck: n soluviljelmää käsiteltiin cocktaililla hiiren anti-histoneja (pan) ja kanin anti-PMP 70 (peroksisomaalinen kalvoproteiini) primaarisia vasta-aineita. Kohdeproteiinit visualisoitiin myöhemmin Goat anti-mouse-ja anti-rabbit-sekundaarisilla vasta-aineilla, jotka on konjugoitu Texas Rediin ja Alexa Fluor 488: aan. Rihmamaisen aktiinin sytoskeletaalinen verkko torjuttiin falloidiniin konjugoidulla Alexa Fluor 350: llä.

klassiset Värjäytymismallit Koiran munuaisten epiteelisoluissa – nykyään perinteistä ja suosittua yhdistelmää Mitotracker Red CMXRos, Alexa Fluor 488 konjugoituna falloidiiniin ja Hoechst 33342 käytettiin kolminkertaistamaan mdck-solujen kiinnittynyt viljelmä. Huomaa epätavallinen rihmamainen aktiiniverkko ja näiden solujen tumia ympäröivien mitokondrioiden suuri määrä.

mitokondrioiden Subsellulaarinen lokalisointi fluoresoivilla proteiineilla Mdck-soluissa-kiinnittymisen ja permeabilisaation jälkeen tässä jaksossa esitetyt mdck-solujen viljelmät merkittiin propidiumjodidilla ja falloidiiniin konjugoidulla Alexa Fluor 350: llä, jotka kohdistuivat DNA: han ja filamenttiaktiiniin. Lisäksi soluihin tehtiin ensin transfektio peyfp-mitokondrio-plasmidilla solunsisäiseen lokalisointivektoriin, jolloin keltainen fluoresoiva proteiinilappu paikallistettiin solunsisäiseen mitokondrioverkostoon.

Madin-Darbyn Koiran munuaisten epiteelisolujen – mikrotubulusten laaja Tubuliiniverkosto värjättiin immunofluoresenssilla käsittelemällä mdck-solujen kiinteää ja permeabiloitunutta viljelmää hiiren alfa-tubuliinin primaarisilla vasta-aineilla, joita seurasi Alexa Fluor 568: aan konjugoitu vuohien anti-hiiri-vasta-aine. Ytimet vastattiin SYTOKSIVIHREÄLLÄ. Vaikka ei kuvattu tässä jaksossa, kulttuuri oli myös merkitty Alexa Fluor 350 konjugoitu falloidin.

Klatriinin, peroksisomien ja tumien samanaikainen visualisointi MDCK – soluviljelmissä-tässä jaksossa esitetty mdck-solujen viljelmä oli immunofluoresenssimerkitty primaarisilla anti-klatriinilla (raskasketju) hiiren monoklonaalisilla vasta-aineilla, joita seurasi vuohen anti-hiiren Fab-fragmentit konjugoituneina syaniiniväriaine Cy3: een sytoskeletaaliseen verkkoon kohdistamiseksi. Lisäksi viljelmässä esiintyvät peroksisomit merkittiin immunofluoresenssisesti sy2: lla konjugoituneena vuohien sekundaarisiin vasta-aineisiin, jotka kohdistuivat kanin anti-PMP 70 (peroksisomaalinen kalvoproteiini 70) primaarisiin vasta-aineisiin. Ytimet vastattiin Hoechst 33342: lla.

Sytokeratiinin Välihehkulankaverkosto Koiran munuaisten epiteelisoluissa-Sytokeratiini on yleinen ja runsas osa välihehkulankaverkostoa epiteelisoluissa. Tämän jakson kiinnittynyt viljelmä merkittiin immunofluoresenssisesti hiiren anti-sytokeratiinilla (pan) primaarisilla vasta-aineilla, joita seurasi Marina Bluelle konjugoitu vuohien Anti-hiiren sekundaariset vasta-aineet. Mitokondriot visualisoitiin MitoTracker – punaisilla Cmxroilla ja ytimet värjättiin SYTOX-vihreillä.

Madin-Darby Canine Kidney Cells with Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, and Hoechst 33258-Simultaaninen localization of tight junctions and the nuclear pore complex proteins (NPCP) was carried immunofluoresence experiment with mdck cells using mouse anti-npcp and rabbit anti-ZO-3 primary vasta-aineita. Subsellulaariset kohteet visualisoitiin käyttämällä Alexa Fluor 488: aan ja Alexa Fluor 568: aan konjugoituja goat anti-mouse ja anti-rabbit secondary vasta-aineita (IgG). Tumien DNA: ta torjuttiin Hoechst 33258: n avulla.

Mitokondrioverkon Immunofluoresenssimerkintä MDCK-soluviljelmissä-Madin-Darby koiran munuaissolut merkittiin immunofluoresenssisesti primaarisilla hiiren anti-oksphos-kompleksilla V inhibiittoriproteiinivasta-aineilla, minkä jälkeen vuohen anti-hiiren Fab-fragmentit konjugoituivat fluoreseiiniin. Kulttuuri värjättiin myöhemmin falloidiniin konjugoidulla Alexa Fluor 568: lla, joka paljasti yksityiskohtia rihmamaisesta aktiiniverkostosta, ja dapilla DNA: sta tumassa.

MitoTracker Red CMXRos, Cy2, and Hoechst 33258 in Madin-Darby Canine Kidney Cells – a fixed and permeabilized adherent culture of Madin-Darby canine kidney cells was immunofluoresently Labed with primary mouse anti-cytokeratine vasta-aineet, and followed goat anti-mouse Fab fragments conjugated to the cyanine dye, Cy2. Ennen kiinnittämistä viljelmää hoidettiin tunnin ajan MitoTracker Red CMXRos-valmisteella, ja vasta-ainehoitojen jälkeen tumat torjuttiin Hoechst 33258-valmisteella.

lektiinien sitoutuminen Golgi-kompleksiin Mdck-Epiteelisoluviljelmissä-jotta lektiini voitaisiin visualisoida Golgi-kompleksiin MDCK-soluissa, siihen kiinnittynyt viljelmä käsiteltiin Oregonin vihreään konjugoidulla vehnänalkioagglutiniinilla. Solujen vastapainoksi annettiin falloidiiniin konjugoitu Alexa Fluor 568, joka paikansi filamenttisen aktiiniverkoston, ja nukleiinihappotahra DAPI, jolla merkittiin DNA tumassa.

kiinnittyneitä Mdck-soluja, joissa oli Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 ja Hoechst 33342 – Alexa-Fluoriväriaineita, käytettiin klatriinin ja peroksisomaalisen kalvoproteiini 70: n (PMP 70) jakautumisen visualisointiin Madin-Darby-koiran munuaisten epiteelisoluviljelmässä. Immunofluoresenssireaktioiden jälkeen solut vastattiin Hoechst 33342: lla tumien sijainnin paljastamiseksi.

Madin-Darby Canine Kidney Cells with MitoTracker Red CMXRos, Alexa Fluor 488, and DAPI – yksi hyödyllisimmistä fluorofore-yhdistelmistä solujen sisäisten yksityiskohtien visualisoinnissa sisältää Mitotracker Red CMXRos kohdistaa mitokondriot, Alexa Fluor 488 konjugoituna falloidiin filamenttisessa aktiiniverkossa, ja DAPI paikallistaa ytimet.

mikrotubulusten ja Aktiinisytoskeletaalisten verkostojen visualisointi MDCK-soluviljelmissä – sekä aktiini-että tubuliiniverkostojen samanaikaiseksi visualisoimiseksi mdck-soluissa käsiteltiin kiinteää ja permeabiloitunutta viljelmää hiiren alfa-tubuliinin primaarisilla vasta-aineilla, minkä jälkeen annettiin cocktail Alexa Fluor 568: aan konjugoituneita vuohien anti-hiiri-sekundaarisia vasta-aineita sekoitettuna falloidiiniin Alexa Fluor 350: n kanssa. Ytimet vastattiin SYTOKSIVIHREÄLLÄ.

Madin-Darby Koiran munuaissoluissa esiintyvien Ydinhuokoskompleksiproteiinien kaksinkertainen immunofluoresenssi ja tiukat liitokset-epiteelisolujen tiiviit liitokset ja ydinhuokoskompleksiproteiinit kuvattiin samanaikaisesti mdck-soluissa hiiren anti-npcp: n ja kanin anti-zo-3: n primaaristen vasta-aineiden cocktaililla, minkä jälkeen vuohien anti-hiiri-ja anti-kani-sekundaaristen vasta-aineiden konjugoituina Alexa Fluor 568: aan ja Alexa Fluor 488: aan. Ytimet vastattiin Hoechst 33258: lla.

tuman ja Golgi-kompleksin läheisyys yksikerroksisissa Mdck-soluviljelmissä-Golgi-kompleksin ja tumakkeiden läheisyyttä Madin-Darby-koiran munuaissoluissa tutkittiin kaksois-immunofluoresenssikokeessa hiiren anti-npcp: llä (nuclear pore complex protein) ja kanin anti-giantin (Golgi complex) primaarisilla vasta-aineilla. Vasta-aine kohteet visualisoitiin vuohien toissijaisilla vasta-aineilla, jotka oli konjugoitu Alexa Fluor 568: aan ja Alexa Fluor 488: aan, kun taas actin cytoskeletal framework oli merkitty Alexa Fluor 350: llä, joka oli konjugoitu falloidiniin.