La carbamoyl phosphate synthétase (CPSase) est une enzyme hétérodimérique composée d’une petite et d’une grande sous-unité (à l’exception de la CPSase III, qui est composée d’un seul polypeptide qui peut être issu de la fusion génique des domaines glutaminase et synthétase). La CPSase a trois sites actifs, un dans la petite sous-unité et deux dans la grande sous-unité. La petite sous-unité contient le site de liaison de la glutamine et catalyse l’hydrolyse de la glutamine en glutamate et en ammoniac, qui est à son tour utilisé par la grande chaîne pour synthétiser le phosphate de carbamoyle. La petite sous-unité a une structure bêta / bêta / alpha à 3 couches, et on pense qu’elle est mobile dans la plupart des protéines qui la portent. Le domaine C-terminal de la petite sous-unité de la CPSase a une activité amidotransférase de la glutamine. La grande sous-unité a deux domaines carboxy phosphate homologues, qui ont tous deux des sites de liaison à l’ATP ; cependant, le domaine carboxy phosphate N-terminal catalyse la phosphorylation du biocarbonate, tandis que le domaine C-terminal catalyse la phosphorylation de l’intermédiaire carbamate. Le domaine carboxy phosphate trouvé dupliqué dans la grande sous-unité de la CPSase est également présent en une seule copie dans les enzymes biotine-dépendantes acétyl-COA carboxylase (ACC), propionyl-Coa carboxylase (PCCase), pyruvate carboxylase (PC) et urée carboxylase.
La grande sous-unité de la CPSase bactérienne possède quatre domaines structuraux : le domaine carboxy phosphate 1, le domaine d’oligomérisation, le domaine carbamoyle phosphate 2 et le domaine allostérique. Les hétérodimères de CPSase d’Escherichia coli contiennent deux tunnels moléculaires: un tunnel d’ammoniac et un tunnel de carbamate. Ces tunnels inter-domaines relient les trois sites actifs distincts, et fonctionnent comme des conduits pour le transport d’intermédiaires réactionnels instables (ammoniac et carbamate) entre des sites actifs successifs. Le mécanisme catalytique de la CPSase implique la diffusion du carbamate à l’intérieur de l’enzyme à partir du site de synthèse dans le domaine N-terminal de la grande sous-unité jusqu’au site de phosphorylation dans le domaine C-terminal.