La carbamoil fosfato sintasi (CPSasi) è un enzima eterodimerico composto da una piccola e una grande subunità (ad eccezione della CPSasi III, che è composta da un singolo polipeptide che può essere sorto dalla fusione genica dei domini glutaminasi e sintetasi). CPSase ha tre siti attivi, uno nella subunità piccola e due nella subunità grande. La piccola subunità contiene il sito di legame della glutammina e catalizza l’idrolisi della glutammina in glutammato e ammoniaca, che a sua volta viene utilizzata dalla grande catena per sintetizzare il carbamoil fosfato. La piccola subunità ha una struttura beta/beta/alfa a 3 strati ed è pensata per essere mobile nella maggior parte delle proteine che la trasportano. Il dominio C-terminale della piccola subunità della CPSasi ha attività della glutammina amidotransferasi. La grande subunità ha due domini carbossi fosfato omologhi, entrambi i quali hanno siti di legame ATP; tuttavia, il dominio carbossi fosfato N-terminale catalizza la fosforilazione del biocarbonato, mentre il dominio C-terminale catalizza la fosforilazione dell’intermedio carbammato. Il dominio carbossi fosfato trovato duplicato nella grande subunità della CPSasi è presente anche come una singola copia negli enzimi biotina-dipendenti acetil-CoA carbossilasi (ACC), propionil-CoA carbossilasi (PCCase), piruvato carbossilasi (PC) e urea carbossilasi.
La grande subunità nella CPSasi batterica ha quattro domini strutturali: il dominio carbossi fosfato 1, il dominio di oligomerizzazione, il dominio carbamoil fosfato 2 e il dominio allosterico. Gli eterodimeri CPSasi di Escherichia coli contengono due tunnel molecolari: un tunnel di ammoniaca e un tunnel di carbammato. Questi tunnel inter-dominio collegano i tre siti attivi distinti e funzionano come condotti per il trasporto di intermedi di reazione instabili (ammoniaca e carbammato) tra siti attivi successivi. Il meccanismo catalitico della CPSasi comporta la diffusione del carbammato attraverso l’interno dell’enzima dal sito di sintesi all’interno del dominio N-terminale della grande subunità al sito di fosforilazione all’interno del dominio C-terminale.