Hydrophobe (HIC) est l’une des méthodes les plus utilisées pour séparer et purifier les protéines à l’état natif. HIC s’avère également très utile pour isoler des complexes protéiques et pour étudier le repliement et le dépliage des protéines. Alors, comment fonctionne HIC? Quels sont les principes derrière cette technique? Pour comprendre le mécanisme derrière ce type de chromatographie, voici certaines choses que vous devez absolument savoir.
Comment Fonctionne HIC?
En un mot, HIC (également connu sous le nom de « salage ») sépare les molécules de protéines en utilisant les propriétés de l’hydrophobie. Dans ce procédé, des protéines contenant à la fois des régions hydrophiles et hydrophobes sont appliquées sur une colonne HIC dans des conditions de tampon à haute teneur en sel.
Le sel dans le tampon (généralement du sulfate d’ammonium) réduit la solvatation des solutés d’échantillon et expose les régions hydrophobes le long de la surface de la molécule de protéine. Ceci facilite l’adsorption de ces régions hydrophobes sur les zones hydrophobes du support solide et précipite (cristallise) les protéines hors de la solution.
Gardez à l’esprit que lors de la réalisation de ce type de chromatographie, l’ajout de sels lyotrophes améliore l’effet hydrophobe et réduit le nombre et le volume de cavités hydrophobes individuelles tout en diminuant la concentration en sel entraînera une désorption du support solide. En tant que tel, l’élution de l’échantillon peut être facilitée par la diminution du gradient de sel. Des modificateurs organiques doux ou des détergents peuvent également être ajoutés au tampon d’élution pour faciliter le processus d’élution.
En utilisant les principes de HIC, vous pouvez lier les protéines des solutions aqueuses à des degrés divers en fonction de la structure de votre protéine d’intérêt, de la concentration en sel, du pH, de la température et des solvants organiques utilisés.
Chromatographie d’interaction hydrophobe: Découvrir les théories sous-jacentes
Il existe trois théories majeures qui peuvent aider à expliquer le mécanisme derrière HIC – (1) la théorie du salage, (2) la théorie thermodynamique et (3) la théorie de la tension superficielle ou des forces de Van der Waals.
Théorie du salage
Selon la théorie du salage, les acides aminés hydrophobes forment des zones hydrophobes protégées lors du pliage en solution aqueuse tandis que les acides aminés hydrophiles permettent aux protéines de se lier aux molécules d’hydrogène dans l’eau. En conséquence, la probabilité que la protéine se dissolve dans l’eau augmentera si suffisamment de zones hydrophiles sont présentes à la surface des molécules de protéines.
Cependant, lors de l’ajout de sels anti-chaotrophes (tels que le sulfate d’ammonium et le sulfate de sodium) dans la solution, certaines des molécules d’eau interagiront avec les ions sels au lieu de la partie chargée de la protéine. Lorsque les interactions protéine-protéine dans la solution deviennent plus fortes que les interactions solvant-soluté, les molécules de protéines réagissent librement les unes avec les autres, ce qui leur permet de s’agréger et éventuellement de précipiter hors de la solution. Par conséquent, l’ajout de sel dans la solution réduit la solubilité de différentes protéines à des degrés divers.
Théorie de la thermodynamique
Cette théorie stipule que l’interaction entre les molécules hydrophobes est un processus entraîné par l’entropie, basé sur la deuxième loi de la thermodynamique. L’interaction hydrophobe entre deux molécules non polaires ou plus dans une solution de solvant polaire est un processus spontané régi par un changement d’entropie. Cependant, de telles interactions peuvent être modifiées en contrôlant la température ou en modifiant la polarité du solvant.
En tant que tel, lorsqu’une molécule non polaire entre en contact avec un solvant polaire tel que l’eau, il y aura une augmentation du degré d’ordre des molécules de solvant entourant la molécule hydrophobe. Tant que l’enthalpie n’augmente pas de manière significative, cela produira une diminution de l’entropie et fournira un changement global positif de l’énergie de Gibbs. Ainsi, la dissolution d’une molécule non polaire dans un solvant polaire ne se produira pas spontanément car elle n’est pas thermodynamiquement favorable.
Cependant, lorsque vous placez deux molécules non polaires ou plus dans un environnement polaire, les surfaces hydrophobes des macromolécules seront cachées de l’environnement polaire et les molécules hydrophobes s’agrégeront spontanément. Les molécules de solvant hautement structurées entourant la surface exposée des molécules hydrophobes seront déplacées vers la majeure partie du solvant constituée de molécules moins structurées. En conséquence, l’entropie augmente tandis que l’énergie de Gibbs diminue. Dans de tels cas, l’interaction hydrophobe devient un processus thermodynamiquement favorable.
Tension superficielle, Théorie de Van der Waals
Cette théorie suggère que l’interaction hydrophobe dans HIC dépend des forces de van der Waals entre les protéines et les ligands immobilisés puisque ces forces augmentent à mesure que la structure ordonnée de l’eau augmente en présence de sels de salage.