Expression améliorée de l’ARNm du PEPCK
L’isoforme cytosolique du PEPCK est un site primaire de régulation de la gluconéogenèse hépatique et rénale (71). Cependant, cette activité n’est pas régulée par des mécanismes allostériques ou par des modifications covalentes. Au lieu de cela, il est régulé uniquement par des mécanismes qui déterminent le niveau de l’ARNm PEPCK et contrôlent ainsi le niveau de la protéine PEPCK. Ceci est accompli par des changements dans le taux de synthèse ou le taux de dégradation de l’ARNm de PEPCK. Le gène PCK1 qui code pour le PEPCK cytosolique est composé de 10 exons et de 9 introns et mesure environ 6 kb de longueur (13). Il code un ARNm unique de 2,6 kb qui est traduit en une protéine contenant 621 acides aminés et ayant une masse de 69 300 Da. Le taux d’ARNm PEPCK dans les reins du rat augmente rapidement après l’apparition aiguë de l’acidose (80). L’augmentation est initiée en 1 heure et atteint un maximum en 7 heures à un niveau six fois supérieur à la normale. Les expériences d’écoulement de transcription (80) ont indiqué que les changements dans la vitesse relative de transcription du gène PCK1 expliquent l’induction initiale de l’ARNm PEPCK. De plus, les changements observés dans les taux d’ARNm du PEPCK étaient étroitement corrélés avec les données antérieures qui mesuraient les changements dans les taux relatifs de synthèse des protéines du PEPCK chez les rats normaux et acidotiques (84). Cependant, le taux sextuple induit d’ARNm PEPCK est maintenu chez les rats qui sont rendus acidotiques chroniquement même si le taux relatif de transcription diminue progressivement et monte à un niveau qui n’est que deux fois supérieur à celui observé chez les rats normaux (81).
Divers segments du promoteur PEPCK, ainsi que le promoteur de base (-460 à +73 pb) contenant des mutations de bloc spécifiques dans des éléments régulateurs ont été largement analysés chez des animaux transgéniques pour déterminer leur rôle dans le contrôle de l’expression du gène PCK1 (72). Le promoteur de base de type sauvage fusionné au gène de l’hormone de croissance bovine (bGH) contient toutes les informations nécessaires pour assurer une expression et une régulation hormonale appropriées dans le foie. Un segment plus grand de 2,3 kb du promoteur PEPCK a été nécessaire pour stimuler l’expression du transgène dans le tissu adipeux. Cependant, ces deux constructions ont été exprimées à de faibles niveaux dans le rein. En revanche, un transgène CRC362 qui ne contient que 362 pb du promoteur mais tous les exons et introns en aval du gène PCK1 du rat a été exprimé à des niveaux normaux dans le rein (40). Ce transgène ne différait du gène endogène que par la substitution d’un segment du gène chicken PCK1 dans la partie de l’exon final qui code le 3′-UTR de l’ARNm de PEPCK. De plus, cette dernière construction présente une induction spécifique rénale significative lorsque les souris transgéniques ont été rendues acidotiques (20).
Les cellules LLC-PK1-F+ présentent une induction sensible au pH de l’ARNm PEPCK (64). Des tentatives antérieures d’identification d’un élément sensible au pH par expression transitoire de diverses constructions rapporteuses de PEPCK-chloramphénicol acétyltransférase dans des cellules LLC-PK1-F+ ont produit des résultats contradictoires (21, 77). Cependant, ces études ont clairement établi que la liaison de HNF-1 à l’élément P2 est essentielle à l’expression basale du PEPCK rénal et que cette interaction protéine-ADN peut contribuer à une augmentation de l’expression lors de l’acidose. Les constructions de luciférase contenant 490 ou 2300 pb du promoteur PEPCK sont fortement activées par cotransfection de cellules LLC-PK1-F+ avec la sous-unité catalytique de la protéine kinase A (112). Cependant, aucune des deux constructions ne présente une activité accrue lorsque les cellules transfectées ont été transférées en milieu acide (pH 6,9, 10 mm de HCO-3) (Wall Q et al., données non publiées, 1999). Cette observation et le fait qu’un transgène ne contenant que 362 pb du promoteur ainsi que les exons et introns en aval sont suffisants pour récapituler l’induction sensible au pH (20) suggèrent que le gène PEPCK peut contenir un élément en aval essentiel à l’augmentation de la transcription sensible au pH. D’autres expériences ont établi que C/EBPß(112) et ATF-2(44) se lient à l’élément CRE-1 du gène PEPCK dans le rein.
Des études antérieures ont également démontré que la demi-vie de l’ARNm PEPCK est augmentée dans le foie en réponse à l’AMPc (76) et aux glucocorticoïdes (132). Une stabilité accrue peut également contribuer à l’induction soutenue de l’ARNm du PEPCK rénal pendant l’acidose chronique (81). Par conséquent, la stabilisation sélective de l’ARNm peut également jouer un rôle important dans la régulation physiologique de l’expression du gène PEPCK. Le système promoteur sensible à la tétracycline a été utilisé pour quantifier la demi-vie de divers ARNM chimériques β-globine-PEPCK (ßG-PCK) dans des cellules LLC-PK1-F+ (67).
L’ARNm ßG-PCK-1, qui contient la totalité du 3′-UTR de l’ARNm PEPCK, a été dégradé avec une demi-vie de 1,2 heure. Le traitement par la RNase H a indiqué qu’une deadenylation rapide était concomitante à une dégradation de l’ARNm ßG-PCK-1. Des études antérieures (108) ont indiqué que la PCK-7, un segment de 50 nt à l’extrémité 3′ de la 3′-UTR, lie une protéine non identifiée qui peut contribuer à la désintégration rapide de l’ARNm PEPCK. Cependant, l’ARNm chimérique ßG-PCK-7 a une demi-vie de 17 heures. L’inclusion du segment PCK-6 adjacent, une région riche en AU de 23 pb, a produit l’ARNm ßG-PCK-6/7 qui a une demi-vie de 3,6 heures. L’ARNm ßG-PCK-3 qui contient la moitié 3′ du 3′-UTR a été dégradé avec la même demi-vie. De manière surprenante, l’ARNm ßG-PCK-2, qui contient l’extrémité 5′ du 3′-UTR, a également été dégradé rapidement (t1/2 = 5,4 heures). Les analyses par décalage de gel d’ARN ont établi que l’AUF1 se lie aux segments PCK-7, PCK-6 et PCK-2 avec une affinité et une spécificité élevées. L’analyse mutationnelle indique que l’AUF1 se lie à une séquence UUAU-UUUAU au sein de PCK-6 et à une structure de boucle de tige et à une région CU adjacente de PCK-7. Ainsi, AUF1 se lie à de multiples éléments déstabilisateurs au sein du 3′-UTR qui participent au renouvellement rapide de l’ARNm de PEPCK. Des expériences plus récentes indiquent que le segment PCK-7 lie également la ζ-cristalline/ NADPH: quinone réductase avec une affinité et une spécificité élevées (Hajarnis et Curthoys, données inédites, 2006). Ainsi, le même mécanisme qui explique l’induction plus progressive des ARNM GA et GDH peut également contribuer à l’augmentation soutenue des taux d’ARNm PEPCK pendant l’acidose chronique.