hidrofób interakciós kromatográfia (HIC) az egyik legszélesebb körben alkalmazott módszer a fehérjék elválasztására és tisztítására natív állapotukban. A HIC nagyon hasznosnak bizonyul a fehérje komplexek izolálásában, valamint a fehérje hajtogatásának és kibontásának tanulmányozásában is. Szóval, hogyan működik a HIC? Milyen alapelvek állnak e technika mögött? Az ilyen típusú kromatográfia mögött meghúzódó mechanizmus megértéséhez itt van néhány dolog, amit feltétlenül tudnia kell.
hogyan működik a HIC?
dióhéjban a HIC (más néven sózás) elválasztja a fehérjemolekulákat a hidrofób tulajdonságok alapján. Ebben a módszerben mind hidrofil, mind hidrofób régiókat tartalmazó fehérjéket viszünk fel egy HIC oszlopra magas sópuffer körülmények között.
a pufferben lévő só (általában ammónium-szulfát) csökkenti a minta oldott anyagainak szolvatációját, és kiteszi a hidrofób régiókat a fehérjemolekula felszínén. Ez megkönnyíti ezen hidrofób régiók adszorpcióját a szilárd hordozón lévő hidrofób területeken, és kicsapja (kristályosítja) a fehérjéket az oldatból.
ne feledje, hogy az ilyen típusú kromatográfia elvégzése során a lotróf sók hozzáadása fokozza a hidrofób hatást, és csökkenti az egyes hidrofób üregek számát és térfogatát, miközben a sókoncentráció csökkenése a szilárd hordozóból történő deszorpciót eredményez. Mint ilyen, a minta elúciója elősegíthető a só gradiensének csökkentésével. Az elúciós pufferbe enyhe szerves módosítókat vagy mosószereket is adhatunk az elúciós folyamat elősegítése érdekében.
a HIC elveinek alkalmazásával különböző mértékben kötheti a fehérjéket a vizes oldatokból, a kérdéses fehérje szerkezetétől, a sókoncentrációtól, a pH-tól, a hőmérséklettől és a felhasznált szerves oldószerektől függően.
Hidrofób Kölcsönhatás Kromatográfia: A mögöttes elméletek feltárása
három fő elmélet segíthet megmagyarázni a HIC mögött meghúzódó mechanizmust: (1) a sózási elmélet, (2) a termodinamikai elmélet és (3) a felületi feszültség vagy Van der Waals – erők elmélete.
sózási elmélet
a sózási elmélet szerint a hidrofób aminosavak védett hidrofób területeket képeznek, amikor vizes oldatban összecsukódnak, míg a hidrofil aminosavak lehetővé teszik a fehérjék kötését a vízben lévő hidrogénmolekulákkal. Ennek eredményeként növekszik annak a valószínűsége, hogy a fehérje vízben oldódik, ha elegendő hidrofil terület van jelen a fehérjemolekulák felületén.
azonban anti-chaotróf sók (például ammónium-szulfát és nátrium-szulfát) hozzáadásával az oldatban a vízmolekulák egy része kölcsönhatásba lép a sóionokkal a fehérje töltött része helyett. Amikor az oldatban a fehérje-fehérje kölcsönhatások erősebbé válnak, mint az oldószer-oldott anyag kölcsönhatások, a fehérjemolekulák szabadon reagálnak egymással – lehetővé téve számukra, hogy aggregálódjanak, és végül kicsapódjanak az oldatból. Ezért a só hozzáadása az oldatban különböző mértékben csökkenti a különböző fehérjék oldhatóságát.
termodinamikai elmélet
ez az elmélet azt állítja, hogy a hidrofób molekulák közötti kölcsönhatás entrópia által vezérelt folyamat, amely a termodinamika második törvényén alapul. A poláris oldószeroldatban két vagy több nem poláros molekula közötti hidrofób kölcsönhatás spontán folyamat, amelyet az entrópia változása irányít. Az ilyen kölcsönhatások azonban megváltoztathatók a hőmérséklet szabályozásával vagy az oldószer polaritásának módosításával.
mint ilyen, amikor egy nem poláros molekula érintkezésbe kerül egy poláris oldószerrel, például vízzel, a hidrofób molekulát körülvevő oldószermolekulák sorrendjének növekedése lesz. Mindaddig, amíg az entalpia nem növekszik jelentősen, ez az entrópia csökkenését eredményezi, és összességében pozitív változást eredményez a Gibbs-energiában. Mint ilyen, egy nem poláros molekula oldódása poláris oldószerben nem fordul elő spontán módon, mivel termodinamikailag nem kedvező.
ha azonban két vagy több nem poláris molekulát poláris környezetbe helyezünk, a makromolekulák hidrofób felületei el lesznek rejtve a poláris környezetből, és a hidrofób molekulák spontán aggregálódnak. A hidrofób molekulák kitett felületét körülvevő erősen strukturált oldószermolekulák a kevésbé strukturált molekulákból álló oldószer nagy része felé tolódnak el. Ennek következtében az entrópia növekszik, míg a Gibbs energia csökken. Ilyen esetekben a hidrofób kölcsönhatás termodinamikailag kedvező folyamatgá válik.
felületi feszültség, van der Waals-elmélet
ez az elmélet azt sugallja, hogy a HIC-ben a hidrofób kölcsönhatás a fehérjék és az immobilizált ligandumok közötti van der Waals-erőktől függ, mivel ezek az erők növekednek, amikor a víz rendezett szerkezete növekszik a sók sózása jelenlétében.