a PEPCK mRNS fokozott expressziója
a PEPCK citoszol izoformája mind a máj, mind a vese glükoneogenezisének elsődleges szabályozási helye (71). Ezt a tevékenységet azonban nem szabályozzák alloszterikus mechanizmusok vagy kovalens módosítások. Ehelyett kizárólag olyan mechanizmusok szabályozzák, amelyek meghatározzák a PEPCK mRNS szintjét, és ezáltal szabályozzák a PEPCK fehérje szintjét. Ez a szintézis sebességének vagy a PEPCK mRNS lebomlási sebességének változásával érhető el. A cytosolic PEPCK-et kódoló PCK1 gén 10 exonból és 9 intronból áll, és körülbelül 6 kb hosszú (13). Egyetlen 2,6 kb-os mRNS-t kódol, amely 621 aminosavat tartalmazó fehérjévé alakul át, amelynek tömege 69 300 Da. A patkány vesében a PEPCK mRNS szintje gyorsan növekszik az acidózis akut megjelenését követően (80). A növekedés 1 órán belül megkezdődik, és legfeljebb 7 órán belül eléri a normálnál hatszor nagyobb szintet. A transzkripciós lefutási kísérletek (80) azt mutatták, hogy a pck1 gén transzkripciójának relatív sebességében bekövetkező változások a PEPCK mRNS kezdeti indukcióját jelentik. Ezenkívül a PEPCK mRNS-szintek megfigyelt változásai szorosan korreláltak a korábbi adatokkal, amelyek a PEPCK fehérjeszintézis relatív arányának változásait mérték normál és acidotikus patkányokban (84). A PEPCK mRNS hatszoros indukált szintje azonban tartósan fennáll a krónikusan acidotikus patkányokban, annak ellenére, hogy a transzkripció relatív sebessége fokozatosan csökken, és a fennsíkok csak kétszer nagyobbak, mint a normál patkányokban megfigyeltek (81).
a PEPCK promoter különböző szegmenseit, valamint a szabályozó elemekben specifikus blokkmutációkat tartalmazó mag promótert (-460 – +73 bp) széles körben elemezték transzgenikus állatokban, hogy meghatározzák szerepüket a pck1 génexpresszió szabályozásában (72). A szarvasmarha növekedési hormon (bGH) génnel fuzionált wildtype core promoter tartalmazza az összes olyan információt, amely a máj megfelelő expressziójának és hormonális szabályozásának biztosításához szükséges. A PEPCK promoter nagyobb, 2,3 kb-os szegmensére volt szükség a transzgén expressziójának elősegítéséhez a zsírszövetben. Mindkét konstrukciót azonban alacsony szinten fejezték ki a vesében. Ezzel szemben egy CRC362 transzgént, amely csak 362 bp-t tartalmaz a promoterből, de a patkány PCK1 gén összes downstream exonját és intronját normál szinten expresszáltuk a vesében (40). Ez a transzgén csak abban különbözött az endogén géntől, hogy a csirke pck1 gén egy szegmensét helyettesítette a végső exon azon részébe, amely a PEPCK mRNS 3′-UTR-jét kódolja. Ezenkívül az utóbbi konstrukció jelentős vese-specifikus indukciót mutat, amikor a transzgenikus egereket acidotikussá tették (20).
az LLC-PK1-F + sejtek a PEPCK mRNS pH-érzékeny indukcióját mutatják (64). Korábbi kísérletek a pH-érzékeny elem azonosítására különféle PEPCK-kloramfenikol-acetil-transzferáz reporter konstrukciók tranziens expressziójával az LLC-PK1-F+ sejtekben ellentmondásos eredményeket hoztak (21, 77). Ezek a vizsgálatok azonban egyértelműen megállapították, hogy a HNF-1 kötődése a P2 elemhez elengedhetetlen a vese PEPCK bazális expressziójához, és hogy ez a fehérje:DNS kölcsönhatás hozzájárulhat az expresszió fokozódásához az acidózis során. A 490 vagy 2300 bp PEPCK promótert tartalmazó luciferáz konstrukciókat erősen aktiválják az LLC-PK1-F+ sejtek kotranszfekciója a protein-kináz a katalitikus alegységével (112). Azonban egyik konstrukció sem mutat fokozott aktivitást, amikor a transzfektált sejteket savas közegbe (pH 6,9, 10 mM HCO−3) (Wall Q et al., publikálatlan adatok, 1999). Ez a megfigyelés és az a megállapítás, hogy a promoterből csak 362 bp-t tartalmazó transzgén a downstream exonokkal és intronokkal együtt elegendő a pH-érzékeny indukció (20) összefoglalásához, arra utal, hogy a PEPCK gén tartalmazhat egy downstream elemet, amely elengedhetetlen a pH-érzékeny transzkripció növekedéséhez. Más kísérletek azt mutatták, hogy a C / EBP (112) és az ATF-2 (44) a vesében a PEPCK gén CRE-1 eleméhez kötődik.
korábbi vizsgálatok azt is kimutatták, hogy a PEPCK mRNS felezési ideje megnövekedett a májban a cAMP (76) és a glükokortikoidok (132) hatására. A megnövekedett stabilitás szintén hozzájárulhat a vese PEPCK mRNS tartós indukciójához krónikus acidózis során (81). Ezért a szelektív mRNS stabilizáció fontos szerepet játszhat a PEPCK génexpresszió fiziológiai szabályozásában is. A tetraciklinre reagáló promoter rendszert használtuk az LLC-PK1-F+ sejtekben található különféle kiméra adapterek felezési idejének számszerűsítésére (67).
a peppk mRNS teljes 3′-UTR-jét tartalmazó, 6,2 órás felezési idővel lebomló (PPG-PCK-1) mRNS-t. Az RNase H-kezelés azt mutatta, hogy gyors deadeniláció következett be az a-ng-PCK-1 mRNS lebomlása. Korábbi tanulmányok (108) azt mutatták, hogy a PCK-7, egy 50-nt szegmens a 3′-UTR 3′-végén, kötődik egy azonosítatlan fehérjéhez, amely hozzájárulhat a PEPCK mRNS gyors bomlásához. A kiméra kb-PCK-7 mRNS felezési ideje azonban 17 óra. A szomszédos PCK-6 szegmens felvétele, egy 23 bp AU-gazdag régió, előállította a 3,6 órás felezési idejű kb-6/7 mRNS-t. A 3′-3′-UTR 3 ‘-felét tartalmazó 3 ‘ -PCK-3 mRNS azonos felezési idővel lebomlott. Meglepő módon a 3′-UTR 5′-végét tartalmazó (T1/2 = 5,4 óra) mRNS is gyorsan lebomlott. Az RNS gel-shift analízisek azt mutatták, hogy az AUF1 nagy affinitással és specifitással kötődik a PCK-7, PCK-6 és PCK-2 szegmensekhez. A mutációs analízis azt mutatja, hogy az AUF1 kötődik a PCK-6-on belüli UUAU-UUUAU szekvenciához, valamint a PCK-7 szár-hurok szerkezetéhez és szomszédos CU-régiójához. Így az AUF1 a 3’ -UTR-en belül több destabilizáló elemhez kötődik, amelyek részt vesznek a PEPCK mRNS gyors forgalmában. Újabb kísérletek azt mutatják, hogy a PCK-7 szegmens nagy affinitással és specifitással is kötődik a ~ -kristály/NADPH: kinon reduktázhoz (Hajarnis and Curthoys, unpublished data, 2006). Így ugyanaz a mechanizmus, amely a GA és a GDH mRNS fokozatosabb indukcióját magyarázza, szintén hozzájárulhat a PEPCK mRNS szintjének tartós növekedéséhez a krónikus acidózis során.