Lo sviluppo e i miglioramenti graduali del sistema a due ibridi di lievito (Y2H) sin dai primi anni ‘ 90 hanno rivoluzionato il modo in cui le interazioni proteiche potevano essere rilevate1.
Il lievito a due ibridi si basa sulla ricostituzione di un fattore di trascrizione funzionale (TF) quando due proteine o polipeptidi di interesse interagiscono. Ciò avviene in ceppi di lievito geneticamente modificati, in cui la trascrizione di un gene reporter porta a un fenotipo specifico, di solito crescita su un mezzo selettivo o cambiamento nel colore delle colonie di lievito. I geni reporter più popolari sono HIS3 per selezionare il lievito su un mezzo privo di istidina e LacZ per schermare il lievito in un test colorimetrico.
I dettagli tecnici di un saggio a due ibridi di lievito sono descritti nel fumetto qui sotto.
Due fusioni (“ibridi”) sono costruite tra ciascuna proteina di interesse e il dominio di legame del DNA (DBD) o il Dominio di attivazione (AD) del TF. La proteina fusa al DBD è indicata come “esca” e la proteina fusa all’ANNUNCIO come “preda”.
Dopo l’interazione tra l’esca e la preda, il DBD e l’AD vengono portati in prossimità e un TF funzionale viene ricostituito a monte del gene reporter. Le fusioni più popolari utilizzano il DBD e l’AD del lievito TF Gal4. La proteina batterica LexA è anche frequentemente utilizzata come DBD in combinazione con Gal4 AD.
Come tecnica genetica, uno schermo a due ibridi di lievito offre un mezzo sensibile ed economico per testare l’interazione diretta tra due proteine mirate o per utilizzare la propria proteina preferita come esca per schermare librerie di frammenti di proteine preparati dai tipi di cellule desiderati, tessuti o interi organismi. L’identità dei partner interagenti viene quindi ottenuta sequenziando i plasmidi corrispondenti nelle colonie di lievito selezionate. Collezioni di proteine a lunghezza intera (“ORFEOMI”) stanno diventando disponibili anche per diverse specie, ma non coprono ancora l’intero proteoma.
Il sistema a due ibridi di lievito è stato rapidamente adottato dalla comunità scientifica e gli schermi in varie specie e campi di ricerca hanno già portato a dozzine di migliaia di pubblicazioni. Rimane il metodo di scelta quando si tratta di scoprire nuove interazioni proteiche, come riflesso dalla letteratura recentemente pubblicata.
Le variazioni di Y2H sono state sviluppate per condurre gli schermi in presenza di un cofattore, o di un enzima richiesto per una data modifica post-traduzionale dei partner proteici2.
Altre versioni consentono di schermare le proteine integrali della membrana3 e la tecnica è stata adattata per rilevare le interazioni proteina-proteina nelle cellule di mammelli4. Infine, sono stati anche ideati protocolli di lievito n-ibrido per esaminare nuove interazioni DNA-protein5, RNA-protein6 e piccole molecole-proteine7.
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1. Fields, S. and Song, O. Un nuovo sistema genetico per rilevare le interazioni proteina-proteina (1989) Nature 340, 245-246
2. Naba, A., Reverdy, C., Louvard, D. e Arpin, M. Reclutamento spaziale e attivazione della chinasi Fes di ezrin promuove lo scattering cellulare indotto da HGF (2008) EMBO J. 27(1), 38-50
3. Stagljar, I., Korostensky, C., Johnsson, N. e te Heesen, S. Un sistema genetico basato sulla split-ubiquitina per l’analisi delle interazioni tra proteine di membrana in vivo (1998) PNAS 95(9), 5187-5192
4. Eyckerman , S., Verhee, A., der Heyden, JV, Lemmens, I., Ostade, XV, Vandekerckhove, J. e Tavernier, J. Progettazione e applicazione di una trappola di interazione basata sul recettore delle citochine (2001) Nat Cell Biol. 3(12), 1114-1119
5. Li, JJ e Herskowitz, I. Isolamento di ORC6, un componente del complesso di riconoscimento dell’origine del lievito da un sistema ibrido (1993) Scienza 262(5141), 1870-1874
6. Il suo nome deriva dal greco antico. A tri-hybrid system for the analysis and detection of RNA–protein interactions (1996) Nucleic Acids Res 24, 4838-4840
7. Licitra, EJ e Liu, JO Un sistema a tre ibridi per la rilevazione di piccole interazioni del recettore ligando-proteina
(1996) PNAS 93(23), 12817-12821