Molecular Expressions Microscopy Primer:Specialized Microscopy Techniques-蛍光デジタルイメージギャラリー-Madin-Darby Canine Kidney Epithelial Cells(MDCK)

S.H.MadinとN.B.Darbyによって成体の雌コッカースパニエルの腎臓組織から誘導され、MDCK細胞株は1958年9月に発生した。 その時以来、細胞は広くβ-アミロイド前駆体タンパク質の処理だけでなく、そのタンパク質分解産物のソートを調査するために利用されています。

ＭＤＣＫ細胞株の形態は上皮であり，細胞は免疫ペルオキシダーゼ染色によりケラチン陽性であった。 ＭＤＣＫ細胞が感受性であるウイルスには、水疱性口内炎（Ｉｎｄｉａｎａ株）、ワクシニア、コクサッキエウイルスＢ５、レオウイルス２および３、アデノウイルス４および５、豚の水疱性発疹、および感染性イヌ肝炎が含まれる。 この細胞は、コクサッケウイルスB3およびb4ならびにポリオウイルス2に対する耐性を示し、逆転写酵素に対して陰性である。

MDCK系統は上皮細胞の一般的なモデルとして一般的に使用されており、上皮として知られる組織のタイプを含む。 主に身体の内臓および他の表面を覆うことが見出され、上皮はシートに組織されたしっかりと充填された細胞で構成される。 これらの細胞は、上皮組織を隣接する組織に固定するのに役立つ基底層と呼ばれる細胞外マトリックスをその基部で分泌する。 上皮細胞はまた、血管への直接のアクセスを欠いており、したがって、代謝廃棄物を取り除くことを余儀なくされるのと同じように、拡散によって酸素 上皮は、保護、吸収、感覚受容、および分泌を含む様々なメカニズムにおいて機能する。 腎臓の上皮細胞は、排泄物の一時的な貯蔵およびその後の分泌において重要な役割を果たす。

上のデジタル画像で提示されたMadin-Darbyイヌ腎臓細胞の培養物を、それぞれ細胞核およびF-アクチン細胞骨格ネットワーク内のDNAを標的とするファロイジンに結合したDapiおよびAlexa Fluor568で標識した。 さらに，細胞にｐｅｙｆｐ-ミトコンドリア（強化黄色蛍光蛋白質）キメラプラスミド細胞内局在ベクターをトランスフェクトした。 画像は、オメガ光学によって提供されるバンドパス発光蛍光フィルター光学ブロックを装備したオリンパスBX-51顕微鏡に結合されたQImaging Retiga Fast-EXiカメラシス 処理段階では，個々の画像チャネルは，蛍光発光スペクトルプロファイルのそれぞれに対応するＲＧＢ値で擬色された。

MITOTRACKER Red CMXRos、Alexa Fluor488、およびDapi-Madin-Darby犬の腎臓細胞の付着培養とMDCK上皮細胞は、それぞれ、ファロイジンに共役MitoTracker Red CMXRosとAlexa Fluor488と細胞内ミトコンドリアネットワークと糸状アク 紫外線吸収プローブＤＡＰＩを用いてＤＮＡを対比染色した。

免疫蛍光によるMadin-Darby腎臓細胞におけるペルオキシソームおよびクラスリンタンパク質の標的化-このセクションでは、MDCK細胞の注目の培養物を、一次抗クラスリン（重鎖）マウスモノクローナル抗体、続いてシアニン色素Cy3に共役したヤギ抗マウスFab断片で免疫蛍光標識し、細胞骨格ネットワークを標的とした。 さらに、培養中に存在するペルオキシソームは、ウサギ抗PMP70（ペルオキシソーム膜タンパク質70）一次抗体に対して向けられたヤギ二次抗体に結合したCy2 核はHoechst33342で対比染色された。

MDCK細胞培養におけるミトコンドリアの強化された黄色タンパク質細胞内局在-Madin-Darby犬の腎臓上皮細胞の培養物は、pEYFP-ミトコンドリア（強化された黄色蛍光タンパク質）キメラプラスミド細胞内局在ベクターでトランスフェクトされました。 細胞はまた、それぞれ、DNAと細胞骨格糸状アクチンネットワークを標的とし、phalloidinに共役SYTOXオレンジとAlexa Fluor350で染色しました。

イヌ腎臓上皮細胞培養におけるヒストンおよびゴルジ複合体の免疫蛍光ターゲティング-Madin-Darbyイヌ腎臓細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、透過処理し、ウサギ（抗giantin）およびマウス（抗ヒストン;pan）一次抗体の混合物で処理し、次にAlexa Fluor488およびTexas Redに共役した二次抗体をそれぞれ処理した。 二次抗体カクテルはまた、同時に糸状アクチンネットワークを標的とするように設計されたphalloidinに共役Alexa Fluor350を含んでいた。

Madin-Darbyイヌ腎臓細胞における核孔複合タンパク質とタイトジャンクションの二重免疫蛍光-上皮細胞タイトジャンクションと核孔複合タンパク質をMDCK細胞で同時にイメージングし、マウス抗NPCPおよびウサギ抗ZO-3一次抗体のカクテルを用い、続いてヤギ抗マウスおよび抗ウサギ二次抗体をそれぞれAlexa Fluor488およびAlexa Fluor568に結合させた。

MDCK細胞におけるミトコンドリアネットワーク-Madin-Darbyイヌ腎臓細胞の付着単層培養物は、初代マウス抗oxphos複合体V阻害剤タンパク質抗体で免疫蛍光標識され、続いてヤギ抗マウスFab断片がフルオレセインに共役した。 培養物は、その後、糸状アクチンネットワークの詳細を明らかにするためにファロイジンに共役Alexa Fluor568、および核内のDNAのためのDAPIで染色した。

小麦胚芽アグルチニン-レクチンを有するMDCK細胞は、タンパク質に結合したり、細胞膜に存在する特定の炭水化物基に結合する植物タンパク質の特 このグループの著名なメンバーであるコムギ胚芽アグルチニンは、蛍光標識実験でゴルジ複合体を局在化するためにしばしば使用される。 この節に示された培養物を、ｔｅｘａｓ Ｒｅｄに結合したコムギ胚芽凝集素、ならびにｐｈａｌｌｏｉｄｉｎおよびＤＡＰＩ（核内のＤＮＡを標的とする）に結合したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４ ８ ８で標識した。

イヌ腎臓細胞培養における蛍光タンパク質によるミトコンドリアの標的化-MDCK細胞のセミコンフルエント培養は、ヒトシトクロムCオキシダーゼのサブユニットVIIIからのミトコンドリア標的化配列に融合した強化黄色蛍光タンパク質（EYFP）のコード配列を含むプラスミドキメラで一過性にトランスフェクトされた。 固定および透過性化の後、細胞を、ファロイジンに結合したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５ ４ ６を用いた糸状アクチンおよび核特異的色素ＤＡＰＩを用いたＤＮＡについて対染色した。

Madin-Darbyイヌ腎臓細胞培養におけるタイトジャンクション-タイトジャンクションタンパク質ZO-3は、MDCK細胞のコンフルエント培養における免疫蛍光によ タンパク質を標的とするウサギ抗ZO-3抗体は、シアニン色素、Cy3に共役ヤギ抗ウサギ二次Fab断片でタグ付けされました。 核はＤＮＡ特異的フルオロフォアＤＡＰＩで対比染色した。

MDCK接着細胞培養Texas Red、Alexa Fluor488、Alexa Fluor350-二重免疫蛍光標識実験では、MDCK細胞の培養をマウス抗ヒストン（pan）とウサギ抗PMP70（peroxisomal membrane protein）一次抗体のカクテルで処理した。 標的タンパク質は、続いて、それぞれ、ｔｅｘａｓ ＲｅｄおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４ ８ ８に結合したヤギ抗マウスおよび抗ウサギ二次抗体で可視化された。 糸状アクチン細胞骨格ネットワークは、phalloidinに共役Alexa Fluor350でcounterstainedました。

犬の腎臓上皮細胞における古典的な染色パターン-mitotracker Red CMXRos、Phalloidinに結合したAlexa Fluor488、およびHoechst33342の伝統的で一般的な組み合わせを使用して、MDCK細胞の付着培養物を 異常な糸状アクチンネットワーク、およびこれらの細胞の核を取り囲む多数のミトコンドリアに注意してください。

MDCK細胞における蛍光タンパク質によるミトコンドリアの細胞内局在-固定および透過化後、本セクションで提示されたMDCK細胞の培養物をヨウ化プロピジウムイオジンおよびAlexa Fluor350で標識し、DNAおよび糸状アクチンを標的とするファロイジンに結合した。 さらに，細胞は最初にｐｅｙｆｐ-ミトコンドリアプラスミド細胞内局在ベクターでトランスフェクトし，黄色蛍光蛋白質タグを細胞内ミトコンドリアネットワークに局在させた。

Madin-Darbyイヌ腎臓上皮細胞-微小管における広範なチューブリンネットワークは、Mdck細胞の固定および透過性培養をマウス抗αチューブリン一次抗体で処理し、alexa Fluor568に共役したヤギ抗マウス抗体に続いて処理することにより、免疫蛍光を用いて染色した。 核はＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎで対比染色した。 このセクションでは画像化されていないが、培養物はまた、ファロイジンに結合したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ３ ５ ０で標識された。

MDCK細胞培養におけるクラスリン、ペルオキシソーム、および核の同時可視化-このセクションで提示されたMDCK細胞の培養は、細胞骨格ネットワークを標的とするために、一次抗クラスリン（重鎖）マウスモノクローナル抗体に続いて、シアニン色素Cy3に共役したヤギ抗マウスFab断片で免疫蛍光標識された。 さらに、培養中に存在するペルオキシソームは、ウサギ抗PMP70（ペルオキシソーム膜タンパク質70）一次抗体に対して向けられたヤギ二次抗体に結合したCy2 核はHoechst33342で対比染色された。

イヌ腎臓上皮細胞におけるサイトケラチン中間フィラメントネットワーク-サイトケラチンは、上皮細胞における中間フィラメントネットワークの一般的で豊富な成分である。 このセクションの付着培養物は、マウス抗サイトケラチン（pan）一次抗体で免疫蛍光標識され、続いてmarina Blueに結合したヤギ抗マウス二次抗体で標識された。 ミトコンドリアをＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒｒｅｄｃｍｘｒｏｓで可視化し，核をＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎで染色した。

Alexa Fluor488、Alexa Fluor568、およびHoechst33258を用いたMadin-Darby犬の腎臓細胞-タイトジャンクションと核孔複合タンパク質（NPCP）の同時局在化は、マウス抗NPCPおよびウサギ抗ZO-3一次抗体を用いたMDCK細胞を用いた二重免疫蛍光実験で行われた。 細胞内標的を、それぞれ、ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４ ８ ８およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５ ６ ８に結合したヤギ抗マウスおよび抗ウサギ二次抗体（Ｉｇｇ）を用いて可視化した。 核内のＤＮＡを、Ｈｏｅｃｈｓｔ３ ３ ２ ５ ８を用いて対比染色した。

MDCK細胞培養におけるミトコンドリアネットワークの免疫蛍光標識-Madin-Darby犬の腎臓細胞は、初代マウス抗oxphos複合体V阻害剤タンパク質抗体で免疫蛍光標識し、続いてヤギ抗マウスFab断片をフルオレセインに結合させた。 培養物は、その後、糸状アクチンネットワークの詳細を明らかにするためにファロイジンに共役Alexa Fluor568、および核内のDNAのためのDAPIで染色した。

Madin-Darbyイヌ腎臓細胞におけるMitoTracker Red CMXRos、Cy2、およびHoechst33258-Madin-Darbyイヌ腎臓細胞の固定および透過性接着培養を、初代マウス抗サイトケラチン抗体で免疫蛍光標識し、続いてヤギ抗マウスFab断片をシアニン色素Cy2に結合させた。 固定の前に、培養物をＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ Ｃｍｘｒｏｓで１時間処理し、抗体処理の後、核をＨｏｅｃｈｓｔ３ ３ ２ ５ ８で対比染色した。

MDCK上皮細胞培養におけるゴルジ複合体へのレクチンの結合-MDCK細胞におけるゴルジ複合体へのレクチン結合を可視化するために、付着培養物をオレゴングリーンに共役した小麦胚芽凝集素で処理した。 その後、細胞は、糸状アクチンネットワークを局在化するためにファロイジンに結合したAlexa Fluor568、および核内のDNAを標識するために核酸染色DAPIで対染色した。

Alexa Fluor488、Alexa Fluor568、およびHoechst33342-Alexa Fluor色素を有する付着MDCK細胞を用いて、Madin-Darbyイヌ腎臓上皮細胞の培養におけるクラスリンおよびペルオキシソーム膜タンパク質70（PMP70）の分布を可視化した。 免疫蛍光反応の後、細胞をHoechst33342で対比染色して、核の位置を明らかにした。

Mitotracker Red CMXRos、Alexa Fluor488、およびDAPIを用いたMadin-Darby犬の腎臓細胞-内部細胞の詳細を可視化するための最も有用なフルオロフォアの組み合わせの一つには、ミトコンドリアを標的とするMitotracker Red CMXRos、糸状アクチンネットワークのためのPhalloidinに共役するAlexa Fluor488、および核を局在化するdapiが含まれる。

MDCK細胞培養における微小管およびアクチン細胞骨格ネットワークの可視化-MDCK細胞におけるアクチンおよびチューブリンネットワークの両方を同時に可視化するために、固定および透過性培養をマウス抗αチューブリン一次抗体で処理し、Alexa Fluor568に結合したヤギ抗マウス二次抗体とphalloidinに結合したAlexa Fluor350を混合した。 核はＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎで対比染色した。

Madin-Darbyイヌ腎臓細胞における核孔複合タンパク質とタイトジャンクションの二重免疫蛍光-上皮細胞タイトジャンクションと核孔複合タンパク質をMDCK細胞で同時にイメージングし、マウス抗NPCPおよびウサギ抗ZO-3一次抗体のカクテルを用い、続いてヤギ抗マウスおよび抗ウサギ二次抗体をそれぞれAlexa Fluor568およびAlexa Fluor488に結合させた。 核をHoechst33258で対比染色した。

単層MDCK細胞培養におけるゴルジ複合体と核の近接性-Madin-Darbyイヌ腎臓細胞におけるゴルジ複合体と核の近接性を、マウス抗NPCP（核孔複合体タンパク質）とウサギ抗giantin（ゴルジ複合体）一次抗体を用いた二重免疫蛍光実験で調べた。 抗体標的は、それぞれAlexa Fluor568およびAlexa Fluor488に結合したヤギ二次抗体で視覚化され、アクチン細胞骨格フレームワークはphalloidinに結合したAlexa Fluor350で標識された。