Molecular Expressions Mikroskopi Primer: Spesialiserte Mikroskopi Teknikker-Fluorescens Digital Image Gallery-Madin-Darby Canine Nyre Epitelceller (MDCK)

Avledet Av S. H. Madin Og N. B. Darby fra nyrevevet av en voksen kvinnelig cocker spaniel, OPPSTO MDCK-cellelinjen i September 1958. Siden den tiden har cellene blitt mye brukt til å undersøke behandlingen av beta-amyloid forløperprotein, samt sorteringen av dets proteolytiske produkter.

morfologien TIL MDCK-cellelinjen er epitelial, og cellene er positive for keratin ved immunoperoksidasefarging. Virus SOM MDCK-celler er utsatt for inkluderer vesikulær stomatitt (Indiana-stamme), vaccinia, coxsackievirus B5, reovirus 2 og 3, adenovirus 4 og 5, vesikulært eksantem av svin og smittsom hundehepatitt. Cellene viser resistens mot coxsackievirus B3 Og B4 samt poliovirus 2, og er negative for revers transkriptase.

MDCK-linjen brukes ofte som en generell modell for epitelceller, som omfatter typen vev kjent som epitel. Hovedsakelig funnet dekker indre organer og andre overflater av kroppen, epitel består av tett pakket celler som er organisert i ark. Disse cellene utskiller en ekstracellulær matrise kalt basallamina ved basen, noe som bidrar til å forankre epitelvevet til tilstøtende vev. Epitelceller mangler også direkte tilgang til blodkar og må derfor skaffe oksygen og næringsstoffer gjennom diffusjon, på samme måte som de blir tvunget til å kvitte seg med metabolske avfallsprodukter. Epitelfunksjon i en rekke mekanismer, inkludert beskyttelse, absorpsjon, sensorisk mottak og sekresjon. Epitelceller i nyrene spiller en nøkkelrolle i midlertidig lagring og påfølgende sekresjon av ekskretjonsmaterialer.

kulturen Av Madin-darby nyreceller presentert i det digitale bildet ovenfor ble merket MED Dapi og Alexa Fluor 568 konjugert til phalloidin, som målretter DNA i cellekjernen og f-actin cytoskeletal-nettverket, henholdsvis. I tillegg ble cellene transfisert med en pEYFP-Mitokondrier (forbedret gul fluorescerende protein) kimær plasmid subcellulær lokaliseringsvektor. Bildene ble tatt opp i gråtoner Med En QImaging Retiga Fast-EXi kamerasystem koblet til En Olympus BX-51 mikroskop utstyrt med bandpass utslipp fluorescens filter optiske blokker levert Av Omega Optisk. Under behandlingsstadiet ble individuelle bildekanaler pseudokolorert MED RGB-verdier som tilsvarer hver av fluoroforemisjonsspektralprofiler.

MDCK Epitelceller Med MitoTracker Røde CMXRos, Alexa Fluor 488, Og DAPI – en tilhenger kultur Av Madin – darby hjørnetann nyreceller ble merket for den intracellulære mitokondrie nettverk og for trådformede aktin Med MitoTracker Røde CMXRos Og Alexa Fluor 488 konjugert til phalloidin, henholdsvis. Den ultraviolettabsorberende sonden DAPI ble brukt til Å motvirke DNA.

Targeting Peroxisomes Og Clathrin Proteiner I Madin-Darby Nyreceller Med Immunfluorescens – I denne delen, kjennetegnet kultur AV MDCK celler ble immunfluorescently merket med primære anti-clathrin (tung kjede) mus monoklonale antistoffer etterfulgt av geit anti-mus Fab fragmenter konjugert til cyanin fargestoff Cy3 for å målrette cytoskeletal nettverket. I tillegg ble peroksisomer tilstede i kulturen immunfluorescent merket Med Cy2 konjugert til geit sekundære antistoffer rettet mot kanin anti-pmp 70 (peroksisomalt membranprotein 70) primære antistoffer. Kjerner ble counterstained Med Hoechst 33342.

Forbedret Gul Protein Subcellulær Lokalisering Av Mitokondrier I MDCK Cellekulturer – en kultur Av Madin-Darby hjørnetann nyre epitelceller ble transfisert med en pEYFP-Mitokondrier (forbedret gul fluorescerende protein) kimær plasmid subcellulær lokalisering vektor. Cellene ble også farget MED SYTOX Oransje Og Alexa Fluor 350 konjugert til phalloidin, rettet MOT DNA og henholdsvis cytoskeletal filamentous actin network.

Immunfluorescens Målretting Av Histoner Og Golgi Kompleks I Hjørnetann Nyre Epitelcellekulturer-Madin-darby hjørnetann nyreceller ble fikset med paraformaldehyd, permeabilized, og behandlet med en blanding av kanin (anti-giantin) og mus (anti-histoner; pan) primære antistoffer, etterfulgt av sekundære antistoffer konjugert Til Alexa Fluor 488 og Texas Red, henholdsvis. Den sekundære antistoffcocktailen inneholdt Også Alexa Fluor 350 konjugert til phalloidin, designet for samtidig å målrette det filamentøse actin-nettverket.

Dobbel Immunfluorescens Av Kjernefysiske Pore Komplekse Proteiner og Tette Veikryss I Madin-Darby Hjørnetann Nyreceller – Epitelceller tette veikryss og kjernefysiske pore komplekse proteiner ble samtidig avbildet I MDCK celler med en cocktail av mus anti-NPCP og kanin anti-ZO-3 primære antistoffer, etterfulgt av geit anti-mus og anti-kanin sekundære antistoffer konjugert Til Alexa Fluor 488 Og Alexa Fluor 568, henholdsvis.

Den Mitokondrielle Nettverk I MDCK Celler – en tilhenger monolayer kultur Av Madin – darby hjørnetann nyreceller ble immunfluorescent merket med primære mus anti-oxphos komplekse v inhibitor protein antistoffer, etterfulgt av geit anti-mus Fab fragmenter konjugert til fluorescein. Kulturen ble deretter farget Med Alexa Fluor 568 konjugert til phalloidin for å avsløre detaljer om det filamentøse actin-nettverket og DAPI FOR DNA i kjernen.

MDCK-Celler Med Hvetekimagglutinin-Lektiner er en spesialisert klasse av planteproteiner som binder seg til bestemte karbohydratgrupper festet til proteiner eller bosatt i cellemembraner. Et fremtredende medlem av denne gruppen, hvetekim agglutinin brukes ofte til å lokalisere Golgi-komplekset i fluorescensmerkingsforsøk. Kulturen illustrert i denne delen ble merket med hvetekim agglutinin konjugert Til Texas Red, Samt Alexa Fluor 488 konjugert til phalloidin og DAPI (rettet MOT DNA i kjernen).

Målretting Av Mitokondrier Med Fluorescerende Proteiner i Nyrecellekulturer Hos Hunder – en halvkonfluent kultur AV MDCK-celler ble transponert med en plasmid chimera som inneholdt kodingssekvensen for forbedret gult fluorescerende protein (EYFP) smeltet sammen med mitokondriell målsekvens fra underenhet VIII av human cytokrom c-oksidase. Etter fiksering og permeabilisering ble cellene counterstained for filamentous actin Med Alexa Fluor 546 konjugert til phalloidin og FOR DNA med atomspesifikt fargestoff, DAPI.

Tette Veikryss I Madin-Darby Nyrecellekulturer – det tette kryssproteinet ZO-3 ble visualisert ved immunfluorescens i EN konfluent kultur AV MDCK-celler. Kanin anti-ZO-3 antistoffer rettet mot proteinet ble merket med geit – anti kanin sekundære Fab fragmenter konjugert til cyanin fargestoff, Cy3. Kjernene ble counterstained MED DNA-spesifikke fluorofor DAPI.

MDCK-Vedheftende Cellekulturer Med Texas Red, Alexa Fluor 488 og Alexa Fluor 350 – I et dobbelt immunfluorescensmerkingseksperiment ble EN kultur AV MDCK-celler behandlet med en cocktail av mus anti-histoner (pan) og kanin anti-pmp 70 (peroksisomal membranprotein) primære antistoffer. Målproteinene ble deretter visualisert med geit anti-mus og anti-kanin sekundære antistoffer konjugert til Henholdsvis Texas Red og Alexa Fluor 488. Det filamentøse actin cytoskeletal-nettverket ble counterstained Med Alexa Fluor 350 konjugert til phalloidin.

Klassiske Fargemønstre I Nyrepitelceller – den nå tradisjonelle og populære kombinasjonen Av MitoTracker Red CMXRos, Alexa Fluor 488 konjugert til phalloidin og Hoechst 33342 ble brukt til å triple-merke en vedhengende kultur AV MDCK-celler. Legg merke til det uvanlige filamentøse actin-nettverket, og det store antallet mitokondrier som omgir kjernene i disse cellene.

Subcellulær Lokalisering Av Mitokondrier Med Fluorescerende Proteiner I MDCK – Celler-etter fiksering og permeabilisering ble kulturen AV MDCK-celler presentert i denne delen merket med propidiumjodid og Alexa Fluor 350 konjugert til phalloidin, som retter SEG mot HENHOLDSVIS DNA og filamentøs aktin. I tillegg ble cellene først transfisert med en pEYFP-Mitokondrier plasmid subcellulær lokaliseringsvektor, og lokaliserte dermed et gult fluorescerende proteinmerke til det intracellulære mitokondriale nettverket.

Den Omfattende Tubulin Nettverk I Madin-Darby Canine Nyre Epitelceller – Microtubuli ble farget ved hjelp av immunfluorescens ved å behandle en fast og permeabilized kultur AV MDCK celler med mus-anti-alfa-tubulin primære antistoffer etterfulgt av geit anti-mus antistoffer konjugert Til Alexa Fluor 568. Kjerner ble counterstained MED SYTOX Grønn. Selv om det ikke ble avbildet i denne delen, ble kulturen også merket Med Alexa Fluor 350 konjugert til phalloidin.

Samtidig Visualisering Av Clathrin, Peroxisomes, Og Kjerner I MDCK Cellekulturer-kulturen I MDCK celler presentert i denne delen ble immunfluorescently merket med primære anti-clathrin (tung kjede) mus monoklonale antistoffer etterfulgt av geit anti-mus Fab fragmenter konjugert til cyanin fargestoff Cy3 for å målrette cytoskeletal nettverket. I tillegg ble peroksisomer tilstede i kulturen immunfluorescent merket Med Cy2 konjugert til geit sekundære antistoffer rettet mot kanin anti-pmp 70 (peroksisomalt membranprotein 70) primære antistoffer. Kjerner ble counterstained Med Hoechst 33342.

Cytokeratin Intermediate Filament Network i Canine Nyre Epitelceller-Cytokeratin Er en vanlig og rikelig komponent i intermediate filament network i epitelceller. Den tilhørende kulturen i dette avsnittet ble immunfluorescent merket med primære antistoffer mot mus-cytokeratin (pan), etterfulgt av sekundære antistoffer mot geit-mus som er konjugert Til Marineblå. Mitokondrier ble visualisert Med MitoTracker Røde CMXRos og kjernene ble farget MED SYTOX Grønn.

Madin-Darby Hjørnetann Nyreceller Med Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, Og Hoechst 33258-Samtidig lokalisering av tette veikryss og nuclear pore komplekse proteiner (NPCP) ble utført med en dobbel immunfluorescens eksperiment MED MDCK celler ved hjelp av mus anti-NPCP og kanin anti-zo-3 primære antistoffer. De subcellulære målene ble visualisert ved hjelp av geit anti-mus og anti-kanin sekundære antistoffer (IgG) konjugert Til Henholdsvis Alexa Fluor 488 og Alexa Fluor 568. DNA i kjernene ble counterstained ved Hjelp Av Hoechst 33258.

Immunfluorescent Merking Av Mitokondrie Nettverk I MDCK Cellekulturer-Madin – darby canine nyreceller ble immunfluorescent merket med primære mus anti-oxphos komplekse v inhibitor protein antistoffer, etterfulgt av geit anti-mus Fab fragmenter konjugert til fluorescein. Kulturen ble deretter farget Med Alexa Fluor 568 konjugert til phalloidin for å avsløre detaljer om det filamentøse actin-nettverket og DAPI FOR DNA i kjernen.

MitoTracker Røde CMXRos, Cy2 og Hoechst 33258 I Madin-Darby Hjørnetann Nyreceller – en fast og permeabilized tilhenger kultur Av Madin-darby hjørnetann nyreceller ble immunfluorescent merket med primære mus anti-cytokeratin antistoffer, etterfulgt av geit anti-mus Fab fragmenter konjugert til cyanin fargestoff, Cy2. Før fiksering ble kulturen behandlet i en time Med MitoTracker Red CMXRos, og etter antistoffbehandlingene ble kjernene counterstained Med Hoechst 33258.

Binding Av Lektiner Til Golgi – Komplekset I MDCK Epitelcellekulturer-For å visualisere lektinbinding Til Golgi-komplekset I MDCK-celler, ble en vedheftende kultur behandlet med hvetekimagglutinin konjugert Til Oregon Green. Cellene ble deretter counterstained Med Alexa Fluor 568 konjugert til phalloidin å lokalisere filamentous actin nettverk, og nukleinsyre flekken DAPI å merke DNA i kjernen.

Adherent MDCK – Celler Med Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 og Hoechst 33342-Alexa Fluor fargestoffer ble ansatt for å visualisere distribusjon av clathrin og peroxisomal membran protein 70 (PMP 70) i En kultur Av Madin-darby hjørnetann nyre epitelceller. Etter immunfluorescensreaksjonene ble cellene counterstained Med Hoechst 33342 for å avsløre plasseringen av kjernene.

Madin-Darby Nyreceller Med MitoTracker Røde CMXRos, Alexa Fluor 488 og DAPI – En av de mest nyttige fluoroforekombinasjonene for å visualisere interne cellulære detaljer inkluderer MitoTracker Røde CMXRos for å målrette mitokondrier, Alexa Fluor 488 konjugert til falloidin for det filamentøse actin-nettverket, og DAPI for å lokalisere kjernene.

Visualisering Av Mikrotubuli Og Actin Cytoskeletal Nettverk I MDCK Cellekulturer – for samtidig å visualisere både aktin og tubulin nettverk I MDCK celler, en fast og permeabilized kultur ble behandlet med mus anti-alfa-tubulin primære antistoffer, etterfulgt av en cocktail av geit anti-mus sekundære antistoffer konjugert Til Alexa Fluor 568 blandet Sammen Med Alexa Fluor 350 konjugert til falloidin. Kjerner ble counterstained MED SYTOX Grønn.

Dobbel Immunfluorescens Av Kjernefysiske Pore Komplekse Proteiner og Tette Veikryss I Madin-Darby Hjørnetann Nyreceller – Epitelceller tette veikryss og kjernefysiske pore komplekse proteiner ble samtidig avbildet I MDCK celler med en cocktail av mus anti-NPCP og kanin anti-ZO-3 primære antistoffer, etterfulgt av geit anti-mus og anti-kanin sekundære antistoffer konjugert Til Alexa Fluor 568 Og Alexa Fluor 488, henholdsvis. Kjerner ble counterstained Med Hoechst 33258.

Nærhet Av Kjernen Og Golgi Kompleks I Monolayer MDCK Cellekulturer-nærhet Mellom Golgi kompleks og kjerner I Madin – darby hjørnetann nyreceller ble undersøkt i en dobbel immunfluorescens eksperiment med mus anti-NPCP (nuclear pore complex protein)og kanin anti-giantin (Golgi complex) primære antistoffer. Antistoffmålene ble visualisert med geit sekundære antistoffer konjugert Til Henholdsvis Alexa Fluor 568 og Alexa Fluor 488, mens actin cytoskeletal framework ble merket Med Alexa Fluor 350 konjugert til phalloidin.