Forbedret Ekspresjon AV PEPCK mRNA
den cytosoliske isoformen TIL PEPCK er et primært reguleringssted for både lever-og renal glukoneogenese (71). Denne aktiviteten reguleres imidlertid ikke av allosteriske mekanismer eller ved kovalente modifikasjoner. I stedet reguleres det utelukkende av mekanismer som bestemmer NIVÅET AV PEPCK mRNA og derved styrer NIVÅET AV PEPCK-proteinet. Dette oppnås gjennom endringer i enten syntesehastigheten eller nedbrytningsgraden AV PEPCK mRNA. Pck1-genet som koder for den cytosoliske PEPCK består av 10 eksoner og 9 introner og er omtrent 6 kb i lengde (13). Den koder for en enkelt 2,6 kb mRNA som oversettes til et protein som inneholder 621 aminosyrer og har en masse på 69 300 Da. NIVÅET AV PEPCK mRNA i rottenyre øker raskt etter akutt innsettende acidose (80). Økningen initieres innen 1 time og når et maksimum innen 7 timer på et nivå som er seks ganger større enn normalt. Transkripsjon run off eksperimenter (80) indikerte at endringer i den relative frekvensen av transkripsjon AV pck1 genet står for den første induksjon AV PEPCK mRNA. Videre korrelerte de observerte endringene i PEPCK mRNA-nivåene tett med tidligere data som målte endringer i relative mengder PEPCK-proteinsyntese hos normale og acidotiske rotter (84). Imidlertid opprettholdes det seksfoldige induserte NIVÅET AV PEPCK mRNA hos rotter som er kronisk acidotisk, selv om den relative transkripsjonshastigheten gradvis avtar og platåer på et nivå som bare er todelt større enn observert hos normale rotter (81).
Ulike segmenter AV PEPCK-promotoren, samt kjernepromotoren (-460 til +73 bp) som inneholder spesifikke blokkmutasjoner i regulatoriske elementer, har blitt grundig analysert hos transgene dyr for å bestemme deres rolle i å kontrollere PCK1 – genuttrykk (72). Wildtype core promoter smeltet sammen med bovint veksthormon (bgh) – genet inneholder all nødvendig informasjon for å sikre passende uttrykk og hormonell regulering i leveren. Et større 2,3 kb segment AV PEPCK-promotoren var nødvendig for å drive ekspresjon av transgen i fettvev. Imidlertid ble begge disse konstruksjonene uttrykt ved lave nivåer i nyrene. I motsetning TIL DETTE ble ET CRC362-transgen som bare inneholder 362 bp av promotoren, men alle nedstrøms eksoner og introner av rotte-pck1-genet uttrykt ved normale nivåer i nyrene (40). Denne transgen skilte seg fra det endogene genet bare ved substitusjon av et segment av kyllingpck1-genet i delen av den endelige eksonen som koder for 3 ‘ – UTR AV PEPCK mRNA. Videre utviser sistnevnte konstruksjon en signifikant nyrespesifikk induksjon når de transgene musene ble gjort acidotiske (20).
LLC-PK1-F+ celler utviser en pH-responsiv induksjon AV PEPCK mRNA (64). Tidligere forsøk på å identifisere et pH-responsivt element ved forbigående uttrykk for ULIKE PEPCK-kloramfenikol acetyltransferase reporter konstruerer I LLC-PK1-F+ celler produserte motstridende resultater (21, 77). Disse studiene viste imidlertid klart at binding AV HNF – 1 til p2-elementet er avgjørende for basal ekspresjon av nyrepepck, og at dette proteinet:DNA-interaksjon kan bidra til økt ekspresjon under acidose. Luciferase-konstruksjoner som inneholder enten 490 eller 2300 bp AV PEPCK-promotoren aktiveres sterkt ved cotransfection AV LLC-PK1-F + – celler med katalytisk underenhet av proteinkinase A (112). Imidlertid utviser ingen konstruksjon økt aktivitet når de transfiserte cellene ble overført til surt medium (pH 6,9, 10 mM HCO-3) (Wall Q et al., upubliserte data, 1999). Denne observasjonen og funnet at et transgen som bare inneholder 362 bp av promotoren sammen med nedstrøms eksoner og introner er tilstrekkelig til å rekapitulere den pH-responsive induksjonen (20) antyder AT PEPCK-genet kan inneholde et nedstrøms element som er avgjørende for den pH-responsive økningen i transkripsjon. Andre forsøk har vist At C/EBPß (112) og ATF-2 (44) binder SEG TIL CRE-1-elementet I PEPCK-genet i nyrene.
Tidligere studier har også vist at halveringstiden til PEPCK mRNA er økt i leveren som respons på cAMP (76) og glukokortikoider (132). Økt stabilitet kan også bidra til vedvarende induksjon av renal PEPCK mRNA ved kronisk acidose (81). Derfor kan selektiv mRNA-stabilisering også spille en viktig rolle i den fysiologiske reguleringen AV PEPCK-genuttrykk. Det tetracyklin-responsive promoter-systemet ble brukt til å kvantifisere halveringstiden til ulike kimære β-globin-PEPCK (ß-pck) mrna i LLC-PK1-F+ celler (67).
den ß-PCK-1 mRNA, som inneholder hele 3 ‘ – UTR AV PEPCK mRNA, ble degradert med en halveringstid på 1,2 timer. RNase H-behandling indikerte at rask dødenylering forekom samtidig med degradering av ß-PCK-1 mRNA. Tidligere studier (108) indikerte AT PCK-7, et 50-nt-segment ved 3′-enden av 3’ – UTR, binder et uidentifisert protein som kan bidra til rask nedbrytning AV PEPCK mRNA. Den kimære ß-PCK-7 mRNA har imidlertid en halveringstid på 17 timer. Inkluderingen av DET TILSTØTENDE PCK – 6-segmentet, en 23-bp AU-rik region, ga den ß-PCK-6/7 mRNA som har en halveringstid på 3,6 timer. Den ß-PCK-3 mRNA som inneholder 3 ‘- halvparten av 3 ‘ – UTR ble degradert med samme halveringstid. Overraskende nok ble ß-PCK-2 mRNA, som inneholder 5′-enden av 3’-UTR, også degradert raskt (t1 / 2 = 5.4 timer). Rna gel-shift analyser fastslått AT AUF1 binder SEG TIL PCK-7, PCK-6, OG PCK-2 segmenter med høy affinitet og spesifisitet. Mutasjonsanalyse indikerer AT AUF1 binder seg til EN uuau-UUUAU sekvens innenfor PCK-6 og en stem-loop struktur og tilstøtende CU-regionen AV PCK-7. DERMED binder AUF1 til flere destabiliserende elementer innenfor 3 ‘ – UTR som deltar i DEN raske omsetningen AV PEPCK mRNA. Nyere eksperimenter indikerer at pck-7-segmentet også binder ζ-krystallin / NADPH: kinonreduktase med høy affinitet og spesifisitet (Hajarnis and Curthoys, upubliserte data, 2006). Dermed kan den samme mekanismen som står for den mer gradvise induksjonen AV GA og GDH mrna også bidra til den vedvarende økningen I PEPCK mRNA nivåer under kronisk acidose.