de ontwikkeling en de geleidelijke verbeteringen van het gist twee-hybride systeem (Y2H) sinds de vroege jaren 90 een revolutie teweeggebracht in de manier waarop eiwitinteractie kon worden gedetecteerd 1.
Yeast two-hybrid is gebaseerd op het reconstitueren van een functionele transcriptiefactor (TF) wanneer twee eiwitten of polypeptiden van belang interageren. Dit gebeurt in genetisch gemodificeerde giststammen, waarbij de transcriptie van een verslaggeversgen leidt tot een specifiek fenotype, gewoonlijk groei op een selectief medium of verandering in de kleur van de gistkolonies. De populairste verslaggeversgenen zijn HIS3 om gist op een medium te selecteren die histidine ontbreekt, en LacZ om gist in een colorimetrische analyse te screenen.
de technische details van een gist twee-hybride Assay worden geschetst in de cartoon hieronder.
twee fusies (“hybriden”) worden geconstrueerd tussen elk betrokken eiwit en ofwel het DNA-Bindingsdomein (DBD) ofwel het Activeringsdomein (AD) van de TF. De proteã ne die aan DBD wordt gesmolten wordt bedoeld als ‘aas’, en de proteã ne die aan de advertentie als’prooi’ wordt gesmolten.
na interactie tussen het aas en de prooi worden DBD en AD in de nabijheid gebracht en een functionele TF wordt vóór het reporter-gen gereconstitueerd. De meest populaire fusies gebruiken de DBD en AD van de gist Tf Gal4. Het bacteriële eiwit LexA wordt ook vaak gebruikt als DBD in combinatie met Gal4 AD.
als genetische techniek biedt een tweehybride gist-scherm een gevoelig en kosteneffectief middel om de directe interactie tussen twee gerichte eiwitten te testen, of om iemands favoriete eiwit te gebruiken als lokaas voor het screenen van bibliotheken van eiwitfragmenten bereid uit de gewenste celtypes, weefsels of hele organismen. De identiteit van de op elkaar inwerkende partners wordt dan verkregen door de overeenkomstige plasmiden in de geselecteerde gistkolonies te rangschikken. Collecties van volwaardige eiwitten (‘ORFeomes’) komen ook beschikbaar voor verschillende soorten, maar ze bestrijken nog niet het gehele proteoom.
het tweehybridesysteem van gist werd snel door de wetenschappelijke gemeenschap overgenomen en screens op verschillende soorten en onderzoeksterreinen leidden al tot tientallen duizenden publicaties. Het blijft de methode van keus wanneer het komt om nieuwe eiwitinteractie te ontdekken, zoals weerspiegeld door de recent gepubliceerde literatuur.
de variaties van Y2H werden ontwikkeld om schermen in aanwezigheid van een co-factor, of een enzym te leiden dat Voor een bepaalde post-Vertalende wijziging van de eiwitpartners wordt vereist 2.
andere versies maken het mogelijk om geïntegreerde membraanproteins3 te screenen en de techniek werd aangepast om eiwit-eiwitinteracties in zoogdiercellen te detecteren4. Tenslotte, werden de gist n-hybride protocollen ook bedacht om voor nieuwe DNA-protein5, RNA-protein6 en kleine molecuul-eiwitinteracties7 te screenen.
ontdek Hybridenics nieuwste geoptimaliseerde gist Tweehybride Schermservice: ULTImate Y2H.
neem contact op met onze teams van wetenschappers voor gratis advies over uw project.
1. Fields, S. and Song, O. a novel genetic system to detect protein-protein interactions (1989) Nature 340, 245-246
2. Naba, A., Reverdy, C., Louvard, D. en Arpin, M. de ruimtelijke rekrutering en activering van het FES-kinase door ezrin bevordert HGF-veroorzaakte celverstrooiing (2008) EMBO J. 27(1), 38-50
3. Stagljar, I., Korostensky, C., Johnsson, N. en te Heesen, S. Een genetisch systeem dat op split-ubiquitin voor de analyse van interactie tussen membraanproteã nen in vivo (1998) PNAS wordt gebaseerd 95(9), 5187-5192
4. Eyckerman, S., Verhee, A., der Heyden, J. V., Lemmens, I., Ostade, X. V., Vandekerckhove, J. En Tavernier, J. Design and application of a cytokine-receptor-based interaction trap (2001) Nat Cell Biol. 3(12), 1114-1119
5. Li, J. J. and Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system (1993) wetenschap 262(5141), 1870-1874
6. Putz, U., Skehel, P. en Kuhl, D. A tri-hybrid system for the analysis and detection of RNA — protein interactions (1996) nucleïnezuren Res 24, 4838-4840
7. Licitra, E. J. and Liu, J. O. A three-hybrid system for detecting small ligand-protein
receptor interactions (1996) PNAS 93( 23), 12817-12821