hydrofobowa chromatografia interakcji (HIC) jest jedną z najczęściej stosowanych metod oddzielania i oczyszczania białek w ich stanie natywnym. HIC okazuje się również bardzo przydatny w izolowaniu kompleksów białkowych oraz w badaniu fałdowania i rozwijania białek. Jak działa HIC? Jakie są zasady tej techniki? Aby zrozumieć mechanizm tego typu chromatografii, oto kilka rzeczy, które zdecydowanie musisz wiedzieć.
jak działa HIC?
w skrócie, HIC (znany również jako „solenie”) oddziela cząsteczki białka, wykorzystując właściwości hydrofobowości. W tej metodzie białka zawierające zarówno regiony hydrofilowe, jak i hydrofobowe stosuje się do kolumny HIC w Warunkach buforowych o wysokiej zawartości soli.
sól w buforze (Zwykle siarczan amonu) zmniejsza solwację rozpuszczonych próbek i eksponuje regiony hydrofobowe wzdłuż powierzchni cząsteczki białka. Ułatwia to adsorpcję tych regionów hydrofobowych do obszarów hydrofobowych na stałym podłożu i wytrąca (krystalizuje) białka z roztworu.
należy pamiętać, że podczas wykonywania tego typu chromatografii, dodanie soli liotroficznych wzmacnia efekt hydrofobowy i zmniejsza liczbę i objętość poszczególnych ubytków hydrofobowych, podczas gdy zmniejszenie stężenia soli spowoduje desorpcję ze stałego podłoża. W związku z tym wymywanie próbek może być ułatwione poprzez zmniejszenie gradientu soli. Do buforu elucyjnego można również dodać łagodne modyfikatory organiczne lub detergenty, aby wspomóc proces elucji.
stosując zasady HIC, można wiązać białka z roztworów wodnych w różnym stopniu w zależności od struktury interesującego białka, stężenia soli, pH, temperatury i użytych rozpuszczalników organicznych.
Chromatografia Interakcji Hydrofobowych: Odkrycie podstawowych teorii
istnieją trzy główne teorie, które mogą pomóc w wyjaśnieniu mechanizmu stojącego za HIC- (1) teoria solenia, (2) teoria termodynamiczna i (3) Napięcie powierzchniowe lub teoria sił Van der Waalsa.
teoria solenia
zgodnie z teorią solenia, hydrofobowe aminokwasy tworzą chronione obszary hydrofobowe po złożeniu w roztworze wodnym, podczas gdy aminokwasy hydrofilowe pozwalają białkom wiązać się z cząsteczkami wodoru w wodzie. W rezultacie prawdopodobieństwo, że białko rozpuści się w wodzie, wzrośnie, jeśli na powierzchni cząsteczek białka znajdzie się wystarczająco dużo obszarów hydrofilowych.
jednak po dodaniu soli anty-chaotroficznych (takich jak siarczan amonu i siarczan sodu) w roztworze, niektóre cząsteczki wody będą oddziaływać z jonami soli zamiast naładowanej części białka. Kiedy interakcje białko-białko w roztworze stają się silniejsze niż interakcje rozpuszczalnik-rozpuszczony, cząsteczki białka reagują swobodnie ze sobą-umożliwiając im agregowanie i ostatecznie wytrącanie się z roztworu. Dlatego dodatek soli w roztworze zmniejsza rozpuszczalność różnych białek w różnym stopniu.
teoria termodynamiki
teoria ta stwierdza, że interakcja między cząsteczkami hydrofobowymi jest procesem napędzanym entropią, opartym na drugim prawie termodynamiki. Hydrofobowa interakcja między dwiema lub więcej niepolarnymi cząsteczkami w polarnym roztworze rozpuszczalnika jest procesem spontanicznym regulowanym przez zmianę entropii. Jednakże takie interakcje mogą być zmieniane przez kontrolowanie temperatury lub modyfikowanie polaryzacji rozpuszczalnika.
jako takie, gdy cząsteczka niepolarna wejdzie w kontakt z polarnym rozpuszczalnikiem, takim jak woda, nastąpi wzrost stopnia uporządkowania cząsteczek rozpuszczalnika otaczających cząsteczkę hydrofobową. Dopóki entalpia Nie wzrośnie znacząco, spowoduje to spadek entropii i zapewni ogólną pozytywną zmianę energii Gibbsa. Jako takie, rozpuszczanie niepolarnej cząsteczki w polarnym rozpuszczalniku nie nastąpi samoistnie, ponieważ nie jest korzystne termodynamicznie.
jednak, gdy umieścisz dwie lub więcej niepolarnych cząsteczek w środowisku polarnym, hydrofobowe powierzchnie makrocząsteczek zostaną ukryte przed polarnym otoczeniem, a hydrofobowe cząsteczki zbiorą się spontanicznie. Wysoce ustrukturyzowane cząsteczki rozpuszczalnika otaczające odsłoniętą powierzchnię cząsteczek hydrofobowych zostaną przesunięte w kierunku większości rozpuszczalnika składającego się z mniej ustrukturyzowanych cząsteczek. W konsekwencji Entropia wzrasta, podczas gdy energia Gibbsa maleje. W takich przypadkach oddziaływanie hydrofobowe staje się procesem termodynamicznie korzystnym.
napięcie powierzchniowe, teoria Van der Waalsa
teoria ta sugeruje, że oddziaływanie hydrofobowe w HIC jest zależne od sił van der Waalsa między białkami a unieruchomionymi ligandami, ponieważ siły te zwiększają się wraz ze wzrostem uporządkowanej struktury wody w obecności soli solących.