as células T do receptor do antigénio quimérico (CAR-T) mostraram uma actividade notável nas neoplasias hematológicas. As moléculas do carro são criadas pela fusão do fragmento variável de cadeia única (scFv) derivado de um anticorpo que visa um antigénio de superfície com o domínio de sinalização da célula T. Estas moléculas são enxertadas em células T através de um processo de engenharia que mais comumente usa Retro – ou lentivírus, ou, em alguns casos, plasmídeos. O CD19 é um alvo racional para doenças malignas das células B, incluindo linfomas, uma vez que é expresso em células B durante todos os estágios de diferenciação, bem como em células que têm transformação maligna . As células CAR-T dirigidas contra o CD19 apresentaram excelentes respostas em doentes com linfomas das células B recidivantes ou refractárias, particularmente linfoma difuso de grandes células B (DLBCL) com algumas remissões duradouras observadas , obtendo a aprovação da FDA para esta indicação. No entanto, alvos alternativos são necessários para outros tipos de linfoma que não têm expressão CD19, incluindo doenças como linfoma de Hodgkin clássico (HL), linfoma anaplástico de grandes células (ALCL) e outros linfomas de linfócitos T.
embora a maioria dos doentes com HL estejam curados com terapias de primeira linha, cerca de 15% dos doentes têm doença refractária primária ou recidiva posterior após uma resposta inicial ao tratamento . O padrão de cuidados para os doentes que recidivam após o tratamento de primeira linha é a quimioterapia de dose elevada seguida de transplante autólogo de células estaminais (TSC), com cerca de metade dos doentes a recidivar após o transplante . Infelizmente, o prognóstico para estes pacientes é pobre, com transplante alogénico de células estaminais (alosct) tradicionalmente oferecendo a melhor chance de remissão sustentada . No entanto, este tratamento também está associado a morbilidade e mortalidade significativas. São necessárias terapêuticas novas para doentes com LH recidivante e refractário.
ALCL é um subtipo de linfoma periférico das células T com características heterogéneas . Embora o prognóstico para linfoma anaplástico ALCL-positivo (ALK+) seja bom, com taxas de sobrevivência de 5 anos geralmente variando de 70 a 90%, ALK-negativo ALCL tem um prognóstico mais guardado, com taxas de sobrevivência de 5 anos de 40-60% . A terapêutica de recurso para doentes com doença quimiossensível consiste geralmente em quimioterapia de dose elevada seguida de TSC. No entanto, o prognóstico para pacientes com recidiva/refratário ALCL que não são elegíveis para transplante ou falha terapêutica de segunda linha é sombrio, com um estudo retrospectivo, mostrando uma mediana de sobrevida livre de progressão e sobrevida global de 3 e 1,8 meses, respectivamente . Por conseguinte, são necessárias abordagens de tratamento alternativas para o tratamento de doentes com ALCL recidiva ou refractária.
uma característica definidora para ambos HL e ALCL é a presença de uma molécula de superfície comum, CD30, um receptor transmembranar e membro da superfamília do receptor de necrose tumoral (TNF). O CD30 também é expresso em outros linfomas, incluindo universalmente na papulose linfomatóide e em alguns casos de DLBCL, linfoma primário das células B mediastinal, fungoides micoses, linfoma periférico das células T e Leucemia/Linfoma adulto das células T. Novos tratamentos também são necessários para estes linfomas, especialmente para pacientes que não respondem ao tratamento inicial.
CD30 é um excelente candidato para terapias imunitárias, devido à sua expressão restrita nas células tumorais , com expressão limitada em pequenos subconjuntos de linfócitos normais activados (não malignos), levando a um baixo risco para o tumor fora da toxicidade alvo.
CD30 tem sido extensivamente explorado como terapia à base de anticorpos, desde nua até imuno-conjugada. O mais notável resultados foram conseguidos com brentuximab vedotin (BV), um anticorpo conjugado de droga dirigida contra CD30, o que, de fato, tem mostrado boa tolerância, bem como promissora atividade no CD30+, linfomas, com uma taxa de resposta (ORR) de 75% e de resposta completa (RC) taxa de 34% em pacientes com recidivado ou refratário HL e um ORR de 86% e CR taxa de 57% em recidivado ou refratário sistêmica ALCL . Embora o BV pareça ter excelentes respostas, estas não são geralmente duráveis com apenas 22% dos doentes com HL recidivante ou refractário que não progrediram ao fim de 5 anos . Para superar alguns dos desafios com a terapia baseada em anticorpos, nomeadamente persistência limitada e penetração do tumor, as células CAR-T foram exploradas. O sucesso e a tolerabilidade da BV provaram a viabilidade de visar CD30 com células CAR-T.
estudos pré-clínicos de células CAR-T direccionadas para CD30
os primeiros estudos de células CAR-T direccionadas para CD30 foram realizados no final dos anos 90 por Hombach et al. e demonstrou citólise eficaz das linhas celulares CD30+ HL in vitro . No entanto, estas moléculas CAR car car car car car car car car car car Não careciam de sinalização co-estimulante, o que limitou a sua eficácia. Savoldo et al. proposta para expressar esta molécula de carro em células T citotóxicas específicas do vírus (vírus Epstein Barr) (EBV-CTLs) para garantir que estas células quiméricas receberam sinais Co-estimuladores adequados ao longo do tempo. Como esperado, estas células mantiveram a sua capacidade de reconhecer e matar tumores EBV+, enquanto, ao mesmo tempo, visavam células CD30+ cancerosas (tais como linhas celulares de tumor HL e ALCL) tanto in vitro quanto in vivo em um modelo de rato xenogeneico . Os avanços subsequentes no processo de engenharia introduziram endodomas Co-estimuladores dentro da molécula do carro, o que tornou a fabricação menos pesada e a necessidade de células T com dupla especificidade antigênica obsoleta .
Independentemente disso, estes estudos abordaram os principais desafios teóricos associados à orientação da molécula CD30. Em primeiro lugar, o aumento dos níveis de CD30 solúvel está presente no plasma de doentes com LH e ALCL, suscitando preocupações de concorrência para a ligação ao carro . No entanto, estudos in vitro demonstraram que níveis elevados de solúvel CD30 não exerçam um impacto negativo na atividade de CD30-direção CARRO-células T , provavelmente porque o epítopo alvo do CARRO não é mantida na forma solúvel da molécula ou porque várias moléculas imobilizadas são necessárias para ativar o CARRO de sinalização.
Second, these studies explored expression levels for CD30 molecule to sensitize CAR-T cells killing. O CD30 é expresso transitoriamente por um subgrupo de linfócitos após activação, suscitando preocupações quanto à eliminação prematura das células T ou B durante as respostas do vírus. Estudos ex vivo extensivos, no entanto, descartaram esta questão, sugerindo que o nível de upregulação CD30 nas células T de memória respondendo à estimulação antigénica associada ao vírus é menor do que o presente nas células tumorais, e, portanto, incapaz de ativar completamente a máquina de matar. Antigen detecção de CARRO moléculas está se tornando uma característica importante, como expressão diferencial de segmentáveis moléculas entre normal vs células tumorais, em última análise, irá ditar a seleção do scFv para aplicações de CARRO contra tumores sólidos. No entanto, o potencial das células T direccionadas para o CD30 para eliminar as células T allo-reativas ou células T reguladoras (Tregs), que parecem expressar o CD30 a um nível significativamente mais elevado, permanece por explorar, e pode abrir esta abordagem para outras aplicações no campo de transplante de células estaminais.
um aspecto importante Final abordado nestes estudos pré-clínicos foi a resistência de algumas células CD30+ a mortes mediadas por células CAR-T. O CD30 é, de facto, expresso pelas células estaminais hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs) durante a activação , conduzindo potencialmente a distúrbios da hematopoiese, incluindo aplasia da medula óssea. Contudo , quando se comparou a potência das células CAR-T direccionadas para CD30 com as células HSPCS CD30+ e as células linfomas t cutâneas CD30+ MyLa, observou-se uma actividade mínima relativamente às primeiras. Além disso, os HSPCs que foram classificados em células CD30+ e CD30 mostraram apenas citólise ligeiramente mais elevada na presença de células CAR– T, que foi, no entanto, muito mais baixa em comparação com a lise de células linfomas de MyLa . Os HSPCs que foram co-cultivados com células CAR-T direccionadas para CD30 também tinham formação de colónias mielóides normal, com apenas uma ligeira diminuição na formação de colónias eritrocitárias. Importante, a transferência adoptiva de células autólogas CD30 direccionadas para o carro-T durante a reconstituição do HSPC em ratinhos humanizados não produziu qualquer alteração nas células T e B periféricas humanas, sugerindo hematopoiese preservada , e confirmando a ausência de toxicidade significativa na medula óssea.
in addition to the differential expression of CD30 on HSPCs at a level that is below the threshold for CAR-T cell activation, some intrinsic resistance of progenitor cells seems likely. Os HSPCs expressam níveis mais elevados de protease de serina SP6/PI-9 que inactiva a granzyme B, uma importante facilitadora da apoptose mediada pelas células T. Embora diferentes células utilizem estratégias diferentes, esta observação é consistente com estudos em células embrionárias e tumores que, apesar de expressarem CD30, são mais resistentes ao abate de células CAR-T.
ensaios clínicos em células CAR-T direccionadas CD30
dois ensaios em células CAR-T direccionadas CD30 foram publicados até à data, com ambos os ensaios mostrando que este tratamento é bem tolerado com alguma actividade anti-tumoral (Tabela 1). Os dois estudos utilizaram diferentes scFv, sinais costimulatórios, sistemas de entrega, regimes de preparação e doses, tornando as comparações difíceis de realizar, ao mesmo tempo fornecendo amplos cenários de função.
Wang et al. 18 doentes tratados com linfoma CD30+ recidivante/refractário (17 com HL e 1 com ALCL cutânea) com um carro anti-CD30 . Este carro (derivado do anticorpo AJ878606.1) utilizou o endodomain costimulatório 4-1BB e um vetor lentiviral para engenharia de células T. Dos 18 doentes tratados, 9 tinham recebido ASCT e 5 tinham sido tratados com BV. Os doentes receberam uma dose média de 1.56 × 107 células CAR-T / kg após um regime linfodepletante, consistindo em 3 combinações diferentes, o que causou algum grau de citopenias . Todos os doentes tiveram uma reacção à perfusão febril de grau 1 ou 2 (febres e calafrios) que recuperou durante a noite. Houve apenas duas toxicidades de grau 3 ou superiores: um doente apresentou anomalias nos testes da função hepática que se revelaram secundárias à toxicidade causada por linfodepleção e um doente teve disfunção sistólica, provavelmente relacionada com a exposição prévia à antraciclina. Não houve síndrome de libertação de citoquinas.
de 18 doentes tratados e avaliáveis para Resposta, 7 doentes apresentaram uma resposta parcial (PR) e 6 doentes apresentaram doença estável (DP) após perfusão não houve CR e a ORR foi de 39%. A mediana da sobrevivência livre de progressão foi de 6 meses, tendo 4 doentes continuado com resposta no momento da publicação. Houve 5 doentes que receberam uma segunda perfusão de células CAR-T, com 3 Doentes a manter PR após o 2º tratamento, 1 doente a manter SD e 1 doente a obter um PR após terem sido avaliados como tendo SD após a 1ª perfusão. Os gânglios linfáticos pareciam responder melhor ao tratamento do que a doença extranodal, e as lesões pulmonares pareciam responder menos ao tratamento, embora seja difícil tirar conclusões com um tamanho de amostra tão pequeno.
Na maioria dos pacientes tratados, de CARRO transgene níveis no sangue periférico, atingiu um pico de 3 a 9 dias após a infusão e diminuiu à linha de base em 4 a 8 semanas após a infusão Maior números de CARRO transgenes bem como uma diminuição do número de CD30+ células tumorais foram encontrados nos poucos pacientes que tinham tumor biopsias realizadas naquele tempo, sugerindo que a CAR-células T traficadas para o tumor de sites.
Ramos et al. foram notificados os resultados de 9 doentes com linfoma CD30+ recidivante/refractário (6 com HL, 1 com ALCL negativa cutânea ALK, 1 com ALK+ ALCL sistémica e 1 com DLBCL evoluiu para HL) . Para este ensaio, O CAR CD30 (derivado do anticorpo HSR3) foi combinado com um endodomain costimulatório CD28 e administrado em células T através de um vector gammaretroviral . Dos 9 doentes tratados, 8 apresentavam doença activa no momento da perfusão celular. Todos os doentes foram fortemente pré-tratados e tiveram recidiva após 3 ou mais linhas terapêuticas anteriores, 7 tinham sido previamente tratados com BV e 6 tiveram recidiva após TSC.
os doentes receberam até 2 × 108 células CD-T direccionadas para o carro / m2 sem um regime de linfodepleção administrado antes da perfusão . O tratamento foi bem tolerado sem notificação de toxicidades atribuíveis às células CAR-T ou episódios de síndrome de libertação de citoquinas. Os autores também monitorizaram a imunidade das células T aos antigénios virais antes e após a perfusão e não detectaram qualquer diferença na resposta das células T aos agentes patogénicos virais comuns . Além disso, não houve notificações de infecções virais após o tratamento com células CD30 CAR-T.
de 8 doentes tratados com doença activa no momento da perfusão, 2 doentes entraram em CR com 1 doente com ALK+ ALCL a manter CR durante 9 meses antes da recaída, e o outro doente com HL a continuar em CR durante mais de 2, 5 anos no momento da publicação . Três doentes tinham SD e 3 doentes tinham doença progressiva. O único doente Tratado que já estava em CR no momento da perfusão após receber quimioterapia de recuperação pós-ASCT manteve uma CR durante mais de 2 anos no momento da publicação. A maioria das respostas foram observadas em doentes que receberam a dose mais elevada. Verificou-se uma expansão dose-dependente das células CAR-T no sangue periférico e os níveis atingiram o pico no período de 1 semana após a perfusão e diminuíram posteriormente, mas os sinais de automóveis foram ainda detectáveis 6 meses após a perfusão em 6 doentes .
apesar de ambos os estudos demonstrarem boa tolerabilidade e alguns efeitos, os resultados são modestos em comparação com os obtidos com as células CD19 direccionadas para o carro-T. Existem actualmente vários ensaios clínicos em curso com diferentes estruturas de células CD30 CAR-T em linfomas recidivantes/refractários que abordam formas de melhorar o resultado (Tabela 2).
direções Futuras de CD30-direção CARRO-células T
Dissecando as estratégias para aumentar a CD30-CARRO de células T precisam ser gradual e multifacetada.
em primeiro lugar, os regimes linfodepletivos devem ser cuidadosamente considerados (Fig. 1a). A quimioterapia de linfodepleção ou condicionamento administrada antes da perfusão das células CAR-T melhora claramente a persistência e eficácia das células CAR-T. A quimioterapia linfodepletora reduz a carga tumoral do paciente e o número de células supressivas . O microambiente HL, em particular, tem numerosas células inibitórias, incluindo Tregs, células T auxiliares tipo 2, e macrófagos associados ao tumor (TAM), que suportam a sobrevivência de células Hodgkin Reed Sternberg (HRS), as células malignas em HL . Assim, no LH, a linfodepleção pode adicionalmente tornar as células linfomas mais susceptíveis à eliminação das células CAR-T, perturbando este microambiente inibitório. Finalmente, a linfodepleção remove células do lava-louças concorrentes, tornando as citocinas IL-7 e IL-15 prontamente disponíveis para a expansão das células CAR-T.
a. A quimioterapia Linfodepletora reduz o número de células supressivas, tais como células T regulamentares e células auxiliares tipo 2, o que pode perturbar o microambiente tumoral. Também estimula a produção de citocinas, como IL-7 e IL-15, que podem promover a expansão das células CAR-T. b. As células Hodgkin Reed-Sternberg produzem timo e quimiocina/CC chemokine ligand 17 (TARC/CCL17) e quimiocina derivada de macrófagos (MDC/CCL22), que atraem células auxiliares do tipo 2 e células T reguladoras que expressam CCR4. As células CAR-T que são projetadas para expressar CCR4 podem ter melhorado o tráfico para o local do tumor. C. verificou-se que as células anti-CD30 CAR-T exprimem PD-1, o que sugere que podem ser susceptíveis à via PD-1/PD-L1 que conduz à inibição imunitária. Além disso, as células Hodgkin Reed-Sternberg também expressam PD-L1, que pode ter um efeito inibitório sobre as células CAR-T expressando PD-1. Os inibidores do ponto de controlo podem interromper a via PD-1/PD-L1 e levar a uma melhor expansão e persistência das células CAR-T. Os factores de crescimento, tais como o factor estimulante de colónias 1 (CSF1), estimulam os macrófagos associados ao tumor (TAM) a serem anti-inflamatórios e promovem o desenvolvimento tumoral. As associações com inibidores do receptor CSF1 (CSF1R) podem ajudar a interromper o microambiente tumoral inibitório e a melhorar a eficácia das células CAR-T
desconhece-se o regime óptimo de linfodepleção a utilizar com as células CD30 CAR-T. No seu ensaio clínico de células CD30 direccionadas para o carro-T, Wang et al. pacientes tratados com 1 de 3 diferentes condicionado regimes (composto de fludarabine e ciclofosfamida, ou gemcitabine, mustargen e ciclofosfamida, ou nab-paclitaxel e ciclofosfamida), mas não encontramos uma diferença estatisticamente significativa entre eles . Muitos estudos em curso utilizam a fludarabina e a ciclofosfamida como linfodeplecção, extrapolando a partir de dados de ensaios clínicos com CAR-T direccionados para CD19 (Ver Tabela 2; NCT02259556, NCT02917083, NCT03049449). Um regime alternativo explorado combina a fludarabina e a bendamustina como linfodepleção (NCT02690545). Outra abordagem consiste em injectar os doentes com células CD30 CAR-T como consolidação após a ASCT. Neste cenário, a ASCT atua como o regime de linfodepleção final, levando a altos níveis de citoquinas estimuladoras, como IL-7 e IL-15, que podem suportar a expansão das células CAR-T e eliminar as células linfóides supressivas . Está em curso um ensaio clínico em doentes com linfomas CD30+ (NCT02663297) com células CAR-T direccionadas para CD30, como consolidação após TSC.
outro aspecto importante a considerar para as doenças malignas CD30 é a localização da doença(Fig. 1b). Os linfomas são principalmente uma doença dos tecidos linfóides (gânglios linfáticos e medula óssea), mas os tumores CD30+ apresentam novos desafios. Em HL, o ambiente quimiocino é muito importante na influência que as células se acumulam no tumor . As células HRS produzem timo e quimiocina/CC chemokine ligand 17 regulada pela ativação (TARC / CCL17) e quimiocina derivada de macrófagos (MDC/ccl22). Estas quimiocinas atraem células que expressam seu receptor cognato, CCR4, tais como células auxiliares tipo 2, Tregs, e células supressoras derivadas mielóides (MDSC) . A infiltração destas células protege as células da SHR criando, não apenas um ambiente supressivo, mas também uma barreira física do acesso por linfócitos T citotóxicos. Assegurar o tráfico preferencial de células HL, Savoldo et al. criou células T que, além de expressar o carro CD30, também co-expressou o receptor de quimiocina, CCR4 . Eles descobriram que as células CD30-direcionadas CAR-T que expressaram CCR4 tinha melhorado a migração para o tumor e aumentou a atividade anti-linfoma em comparação com as células CD30-direcionadas CAR-T que não expressaram CCR4 em modelos HL mouse . Uma preocupação com esta abordagem é que o TARC e o MDC são produzidos por outros tecidos, como a pele, o que pode aumentar a toxicidade. No entanto, uma vez que o CD30 não é expresso nestes locais, as células CD30 direccionadas para o carro-T não devem causar no alvo toxicidade tumoral. Em vez disso, as células CD30 direccionadas para o carro – T que co-expressam CCR4 também poderiam ser mais eficazes em linfomas cutâneos CD30+ devido ao aumento do tráfico para a pele. Prevê-se a abertura, num futuro próximo, de um ensaio clínico com CCR4 de células CAR-T direccionadas para CD30 em doentes com linfomas CD30+ recidivantes/refractários.
como descrito acima, o ambiente tumoral de linfomas e HL, em particular, é rico em células inibitórias e moléculas. Portanto, é imperativo considerar associar CAR CD30 com outros reguladores imunológicos. Entre as estratégias candidatas, os inibidores do ponto de controle imunológico (ICIs, Fig. 1c) são chave. Isto é especialmente interessante em HL, onde ICIs têm mostrado excelente atividade de agente único . Além disso, Ramos et al. verificou-se que a PD1 foi expressa em 33% das células CD30 direccionadas para o carro-T , o que sugere que estas células permanecerão sensíveis à via inibitória PD1/PDL1 uma vez no local do tumor. No caso de notificações de doentes que progrediram após receberem células CAR-T direccionadas para CD19 e subsequentemente foram tratados com pembrolizumab, foi observada a re-expansão das células CAR-T CD19 e a resposta clínica . No entanto, é necessário identificar o momento ideal e a sequência da combinação para as células ICIs e CD30 CAR-T. Além disso, desconhece-se o efeito desta Associação nos acontecimentos adversos relacionados com o sistema imunitário e na síndrome de libertação de citoquinas. Alternativamente, com os avanços na engenharia genética, a desregulação selectiva dos receptores inibitórios pelas células CAR T representam alternativas intrigantes .
a presença de MDSC e o seu papel na protecção tumoral em HL também requer testes de combinações com novos moduladores, tais como inibidores do receptor do factor estimulante de colónias 1 (CSF1R), uma vez que a MDSCs express CSF1R . Além disso, os factores de crescimento, tais como o CSF1, estimulam os macrófagos associados ao tumor a serem anti-inflamatórios, ou o fenótipo M2, e promovem o crescimento do tumor . O aumento do número de macrófagos associados ao tumor está associado com pior prognóstico na HL . Este facto corrobora ainda a lógica dos inibidores da CSF1R em estudos de HL e de fase I em inibidores da CSF1R foram testados em HL e mostram boa tolerância, mas eficácia limitada . No entanto, as combinações com células T CD30CAR podem revelar-se benéficas.