O ensaio ELISA produz três tipos diferentes de dados de saída:
Quantitativa
ELISA dados podem ser interpretados em comparação com uma curva padrão (uma diluição em série de uma conhecida, purificada antigen) para calcular com precisão as concentrações de antígeno em várias amostras (Figura 6).O ELISAs também pode ser utilizado para obter uma resposta sim ou não indicando se um determinado antigénio está presente numa amostra, em comparação com um poço em branco sem antigénio ou um antigénio de controlo não relacionado.
Semiquantitativo
ELISAs pode ser usado para comparar os níveis relativos de antigénio em amostras de ensaio, uma vez que a intensidade do sinal varia directamente com a concentração do antigénio.Dados ELISA são tipicamente graficados com densidade óptica vs concentração logarítmica para produzir uma curva sigmoidal, como mostrado na Figura 6. As concentrações conhecidas de antigénio são utilizadas para produzir uma curva-padrão e, em seguida, estes dados são utilizados para medir a concentração de amostras desconhecidas por comparação com a porção linear da curva-padrão. Isto pode ser feito diretamente no gráfico ou com software de ajuste de curva que é tipicamente encontrado em leitores de placas ELISA.
Fig. 6. Uma típica curva ELISA padrão.Modelos da curva de calibração
modelos da curva de calibração
se for necessário um resultado quantitativo, a forma mais simples de proceder é mediar o triplicado das leituras das normas e deduzir a leitura da amostra de controlo em branco. Em seguida, traçar a curva-padrão, encontrar a linha de melhor ajuste ou, pelo menos, desenhar uma curva ponto a ponto para que a concentração das amostras possa ser determinada. Quaisquer diluições feitas precisam ser ajustadas para esta fase. Esta é, em geral, a medida prática em que o cálculo manual pode ser feito.
uma variação é plotar os dados usando semi-log, log/log, log / logit e seus derivados – os modelos logísticos de 4 ou 5 parâmetros. A utilização de soluções baseadas em software/automatizadas permite considerar abordagens mais sofisticadas de grafismo. Usando regressão linear dentro de um pacote de software adiciona várias outras possibilidades de verificação; é possível verificar o valor R2 para determinar a bondade global do ajuste. Para a porção da curva em que a relação de concentração com a leitura tem uma relação linear, os valores de R2 >0.99 representam um ajuste muito bom. A exatidão pode então ser melhorada usando concentrações padrão adicionais nesse intervalo.
um aspecto da parcela linear é que comprime os pontos de dados sobre as concentrações mais baixas da curva-padrão, tornando assim a gama mais precisa (área mais provável de atingir o valor R2 exigido). Para neutralizar esta compressão pode ser usado um gráfico semi-log; aqui o log do valor de concentração (no eixo x) é plotado contra a leitura (no eixo y). Este método dá uma curva de dados em forma de S que distribui mais dos pontos de dados para o padrão sigmoidal mais amigável.
o log / log (log da concentração contra log da leitura) tipo de gráfico consegue linearizar mais da curva de dados. A gama de concentrações de baixo a médio padrão é geralmente linear neste modelo, apenas a extremidade mais alta da Gama tende a inclinar-se para fora. O log / logit e seus derivados, os modelos logísticos de 4 ou 5 parâmetros, são mais sofisticados exigindo cálculos e estimativas mais complexos dos valores max, min, EC50 e declive. Além disso, o modelo de 5 parâmetros requer o valor assimétrico.
embora estes modelos da curva de calibração possam proporcionar um melhor desempenho, um bom ponto de partida seria usar o log-log plot com uma verificação da percentagem de recuperação (recuperação do analito a partir de amostras enriquecidas). Alternativamente, pelo menos “back-fitting” os valores de leitura da curva padrão, é frequentemente uma abordagem “boa o suficiente”. A maneira mais simples de verificar é calcular de volta os padrões de calibração e verificar se eles caem dentro de 20% do valor de leitura nominal. Uma condição é não confiar em valores “bons” R2 e encontrar o modelo da curva de calibração que fornece os melhores valores de recuperação para os padrões.Os testes ELISA são um dos imunoensaios mais sensíveis disponíveis. O intervalo de detecção típico para um ELISA é de 0, 1 a 1 fmole ou de 0, 01 ng A 0, 1 ng, com sensibilidade dependente das características particulares da interacção anticorpo-antigénio. Além disso, alguns substratos, tais como aqueles que produzem um sinal quimioluminescente melhorado ou fluorescente, podem ser usados para melhorar os resultados.
como mencionado anteriormente, a detecção indireta produzirá níveis mais elevados de sinal e deve, portanto, ser mais sensível. No entanto, também pode causar um sinal de fundo mais elevado, reduzindo assim os níveis de sinal específico líquido.