O Papel da Proteína Modificações dos T-Aposta na Produção de Citocina e a Diferenciação de Células T Helper

Resumo

T-Bet (T-caixa de proteína expressa em células T, também chamado como TBX21) foi inicialmente clonado como uma chave fator de transcrição envolvido no compromisso de T helper (Th), as células do tipo Th1 linhagem. T-Bet activa directamente a transcrição do gene IFN e aumenta o desenvolvimento das células Th1. T-Bet modula simultaneamente IL-2 e Th2 citocinas de uma forma independente IFN, resultando em uma atenuação do desenvolvimento de células Th2. Numerosos estudos demonstraram que a t-bet desempenha múltiplos papéis em muitos subtipos de células imunes, incluindo células B, células dendríticas, células NK, células T NK e células linfóides inatas. Portanto, T-bet é crucial para o desenvolvimento e coordenação de respostas imunitárias inatas e adaptativas. Para cumprir estes múltiplos papéis, A T-bet sofre várias modificações proteicas pós-transferacionais, tais como fosforilação em tirosina, serina e resíduos de treonina, e ubiquitinação em resíduos de lisina, que afetam o compromisso da linhagem durante a diferenciação das células T. Esta revisão apresenta uma visão geral atual dos progressos realizados na compreensão dos papéis de vários tipos de modificações de proteínas T-bet na regulação da produção de citocina durante a diferenciação das células T.

1. Introdução

T-Bet (T-caixa de proteína expressa em células T, também chamado de TBX21) foi primeiramente descrita em 2000, um relatório em que analisa os efeitos do T-aposta na diferenciação do T helper 1 (Th1) células . Nos últimos 15 anos, muitos estudos examinaram as funções da T-bet e revelaram múltiplos papéis para esta proteína durante a diferenciação das células T, com foco nos mecanismos moleculares envolvidos, as novas funções deste fator de transcrição nas células imunitárias inatas, e modulação da t-bet-mediada das doenças inflamatórias . Foi esclarecido que o T-bet desempenha um papel fundamental na coordenação da imunidade inata e imunidade adaptativa e que cumpre uma função importante na modulação de doenças inflamatórias crônicas, como asma e doença inflamatória intestinal, controlando uma rede altamente conservada programas genéticos . Assim, uma regulação óptima da expressão e actividade da t-bet parece ser benéfica para a prevenção ou tratamento de inflamação crónica e doenças auto-imunes.

embora tenham sido feitas tentativas para identificar as pequenas moléculas que controlam a expressão e actividade da t-bet que afectam a resposta imunitária mediada pelas células T, poucos progressos foram feitos até à data. Dada a importância do T-bet na regulação imunitária, elucidar os mecanismos funcionais subjacentes aos múltiplos papéis do T-bet facilitaria o desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas para o tratamento de doenças inflamatórias crônicas e autoimunes. Esta revisão resume o estado atual do conhecimento sobre os mecanismos moleculares subjacentes aos múltiplos papéis desempenhados por T-bet no desenvolvimento da célula.

2. Estrutura de T-Bet

O T-bet contém um amino-terminal, uma T-caixa domínio, e um carboxilo-terminus, que mostram 82%, 100% e 79% de homologia, respectivamente, entre ratos (530 amino-ácido resíduo de proteína) e humanos (535 amino-ácido resíduo de proteínas) (Figura 1). O domínio T-box, localizado entre os resíduos 135 e 326 no rato t-bet, é altamente conservado em 18 membros da família T-box protein (TBX). Características comuns compartilhadas pelas proteínas T-box incluem uma capacidade de ligação de DNA através do domínio T-box e atividade reguladora transcritional, que desempenha um papel no controle da expressão do gene de desenvolvimento em todas as espécies animais.

Figura 1

estrutura e modificação proteica da t-bet. O Mouse e o humano t-bet são 100% idênticos no domínio t-box. Vários resíduos de aminoácidos são conservados em ratinhos e submetidos a modificações pós-transferacionais, incluindo fosforilação em resíduos de serina, treonina e/ou tirosina, e ubiquitinação em resíduos de lisina.

o domínio T-box é composto por cerca de 180 resíduos de aminoácidos e é suficiente e necessário para se ligar à sequência de ADN consensual TCACACCT . Braquiúrio (T) foi a primeira proteína t-box a ser identificada e, na forma dimérica, interage com os sulcos maior e menor do DNA através de interações hidrofóbicas e incomum contato carbonil de cadeia principal com a guanina como um dímero . TBX1 também se liga à sequência de DNA como um dímero, enquanto TBX2 parece ligar-se à mesma sequência de DNA como um monômero . Embora TBX1 e TBX2 compartilham 61% de identidade no domínio t-box, a estrutura do complexo de ligação DNA-t-box parece ser diferente, devido à baixa homologia entre as regiões amino – e carboxil-terminais. O domínio t-box em T-bet mostra uma homologia de 50% com o domínio correspondente em brachyury( T), TBX1, e TBX2; no entanto, a estrutura cristalina de T-bet ligada à sequência de DNA permanece a ser caracterizada.

3. Regulação da diferenciação celular por T-Bet

3.1. A estimulação da diferenciação celular Th1 por T-Bet

T-bet liga-se directamente à sequência de ADN consensual no promotor IFNG e activa a sua transcrição. A expressão induzida por T-bet do IFNG deriva em células precursoras th1 para diferenciar-se em células efetoras Th1. Enquanto a sobreexpressão exógena do t-bet nas células TT ingênuas aumenta preferencialmente o desenvolvimento das células Th1, a deficiência do T-bet leva a uma falha na produção suficiente de IFN-γ e, portanto, reduz a geração de células Th1 . A expressão da T-Bet é substancialmente aumentada pela estimulação do receptor da célula T (TCR) e é aumentada por um tratamento de algodão com IFN-γ e IL-12. O IFN-γ liga-se ao seu receptor e induz a activação do transdutor de sinal e activador da transcrição (STAT) 1 e a transcrição do gene T-bet (TBX21). Subsequentemente, T-bet estimula diretamente a transcrição do IFNG, bem como IL12RB2. A expressão do receptor IL-12 (IL-12R) β2 na superfície celular aumenta ainda mais a produção do IFN-γ através do IL-12 e da via de sinalização do STAT4, resultando assim na diferenciação preferencial das células Th1. Curiosamente, a expressão t-bet forçada também pode converter as células T2 diferenciadas em células Th1 . Por conseguinte, a t-bet é posicionada no ponto crucial das vias regulamentares que induzem o IFN-γ nas células T.

3.2. Atenuação da produção IL – 2 Por T-Bet

além da regulação IFN-γ, T-bet suprime significativamente a expressão. Esta citocina, um fator de crescimento precoce das células T, é essencial para a ativação, proliferação e diferenciação das células T e é abundantemente produzida com a estimulação TCR. A t-bet introduzida ectopicamente suprime significativamente a produção IL-2 através da inibição da actividade P65 do factor nuclear (NF-kB), em condições de diferenciação Th1 e Th2 . Durante a diferenciação celular Th1, a transcrição IL-2 é também atenuada na indução da t-bet. A inibição il-2 mediada pela T-bet pode afectar a expansão da célula e modular exquisitamente a resposta imunitária mediada pela Th1 após exposição a um antigénio patogénico.

3.3. Supressão do desenvolvimento celular de Th2 por T-Bet

além disso, a introdução exógena da t-bet nas células T suprime a produção de citoquinas de Th2, tais como IL-4, IL-5 e IL-13, através da supressão da proteína de ligação aos dados-3 (GATA-3). Consequentemente, a ausência de t-bet induz o desenvolvimento espontâneo das células Th2 in vitro e in vivo . A atividade supressiva de T-bet também foi confirmada na ausência de IFN-γ, indicando que T-bet tem uma função inibitória discreta, independente da estimulação IFN-γ.

3.4. Outras Funções de T-Bet

Recentemente, muitos estudos têm relatado que a T-bet também modula outras Th celular linhagens, incluindo Th17, Treg, e folicular Th (TFH) células, em coordenação com muitos fatores de transcrição, tais como o retinoic-relacionados órfã de receptores de yt (RORyt), runt-relacionados com o fator de transcrição 3 (RUNX3), e B-linfoma de células-6 (BCL6) . Estes achados sugerem que T-bet é um fator de transcrição que é fundamental para o desenvolvimento de células T-tuning.

4. A modificação pós-Translacional da T-Bet

t-Bet funciona como um player multitarefa na regulação da diferenciação celular. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes à actividade estimulatória e inibitória da t-bet na regulação da expressão do gene alvo continuam por esclarecer. Muitas proteínas multitasking são conhecidas por sofrer modificações de proteínas pós-translacionais e para determinar o destino celular, exercendo atividade estimulatória direta e inibitória indireta na expressão do gene alvo .

4.1. A fosforilação da tirosina da T-Bet

a detecção de proteínas da T-bet em blots ocidentais resulta em múltiplas bandas, sugerindo a modificação pós-transferacional da T-bet nas células TCR-activadas. A fosforilação de tirosina da proteína T-bet ocorre principalmente durante os estágios iniciais (dias 2 a 3) do desenvolvimento celular de Th, após o engajamento da TCR, e diminui depois. O tratamento das células T com o inibidor da fosfatase de tirosina pervanadato aumenta a fosforilação da tirosina de T-bet. A T-Bet está localizada principalmente no núcleo, e a tirosina cinase il2-indutível tirosina cinase (ITK) foi identificada como a tirosina cinase responsável a montante. A deficiência de ITK previne a fosforilação da tirosina da t-bet nas células T após estimulação com TCR e IL-12. A investigação mutacional revelou que o resíduo de tirosina 525 (Y525) é o local de fosforilação relevante e que a fosforilação neste local desempenha um papel importante na interacção com o GATA-3. Embora o domínio da caixa-T na t-bet seja importante para a interacção ADN-proteína e proteína-proteína, a fosforilação da tirosina de Y525 é um pré-requisito para a supressão da diferenciação das células T2 mediada pelo GATA-3. O bloqueio da fosforilação Y525 revoga a interacção com e supressão do GATA-3, resultando na diminuição da supressão Th2 .

além disso, outra tirosina cinase nuclear, c-Abl, induz fosforilação da T-bet nos resíduos de tirosina 219, 265 e 304 Na t-bet do Ratinho . Uma deficiência em C-Abl, bem como a mutação da T-bet nestes resíduos (mutações Y219/265/304F), leva a uma incapacidade de aumentar a indução IFN-γ e de suprimir a produção de T2 citoquina, devido à perda de fosforilação nestes resíduos de tirosina. Isto, por sua vez, resulta no agravamento da inflamação alérgica pulmonar in vivo . Estes achados sugerem que a fosforilação da t – bet induzida por ITK e C-Abl é essencial para a modulação do desenvolvimento celular de Th2 e para a resposta imune alérgica.

4.2. A fosforilação de serina da T-Bet

embora a supressão mediada pela T-bet do desenvolvimento de células Th2 seja prejudicada pela mutação da Y525 e pela ausência de cinase C-Abl, a supressão IL-2 é mantida com uma t-bet mutante Y525, sugerindo a existência de um mecanismo regulador adicional para a modulação IL-2 . Curiosamente, o aparecimento de múltiplas faixas de proteína T-bet em blots ocidentais poderia ser eliminado pela adição de fosfatase intestinal de vitelo, que elimina predominantemente fosforilação em resíduos de serina/treonina. A análise espectrométrica de massa então revelou serina 508 (S508) como outro local de fosforilação em T-bet. A mutação do S508 elimina a fosforilação mediada pela caseína cinase- (CK-) e glicogen sintase cinase-3 (GSK-3-) em T-bet, bem como a actividade supressiva IL-2 da proteína. Além disso, a fosforilação S508 é importante para a interacção de T-bet com NF-kB P65 e para a prevenção da ligação de NF-kB P65 ao promotor IL2. De acordo com a função da T-bet como inibidor P65 NF-kB, as células T-bet-null Th1 sustentam a actividade p65 NF-kB durante a diferenciação das células Th1, produzindo assim mais IL-2. Portanto, tem sido sugerido que a T-bet é um inibidor fisiológico da IL-2 durante a diferenciação celular Th1, através da supressão dependente da fosforilação do NF-kB P65.

4.3. A fosforilação da treonina de T-Bet

muito recentemente, a treonina 302 (T302) foi caracterizada como um novo local de fosforilação em T-bet , embora não seja claro que a cinase e a fosfatase afetam a fosforilação deste resíduo. No entanto, a restauração de células T-bet-null com um t-bet t-bet mutante estimulou a produção de IFN-γ tanto quanto o t-bet selvagem; no entanto, o mutante não conseguiu suprimir IL-2 e outras citocinas T-2. Uma análise mais aprofundada demonstrou que a fosforilação T302 é necessária para a interacção da T-bet com o factor nuclear das células T activadas (NFAT) e para a redução da regulação das citoquinas IL-2 e Th2 mediadas por NFAT, tais como IL-4, IL-5 e IL-13. A NFAT não é crucial para a indução da produção de IFN-γ e a t-bet mutante de T302 é capaz de se ligar ao promotor de IFNG; assim, a produção de IFN-γ foi comparável entre o tipo selvagem e a t-bet mutante. Por outras palavras, a mutação do T302 revogou a supressão mediada pela t-bet da produção de IL-2 e de Th2 citocina, mas não afectou a actividade de ligação ao ADN e de estímulo IFN-γ da T-bet.

de facto, o T302 está localizado na caixa T de ligação do ADN, tal como o Y304 . O domínio T-box consiste em várias repetições de cadeias β e de hélices α e está envolvido tanto na dimerização como na ligação ao ADN . Muller e Herrmann previram que as α-hélices aH3 e aH4 em braquiúrio (T) são importantes para a interação direta desta proteína com os pequenos e principais sulcos do DNA . Contudo, o T302 pode não estar associado directamente às ranhuras de ADN, independentemente do seu estado de fosforilação. Seria interessante saber qual a quinase e fosfatase a montante que regula a fosforilação T302 e se a fosforilação T302 afeta outras modificações proteicas da T-bet.

4.4. A ubiquitinação da lisina 313 EM T-Bet

t-bet expressão é fundamental para a regulação transcritional da IFNG e para o desenvolvimento das células Th1, mas os meios de regulação da t-bet ao nível proteico ainda não foram identificados. Jang et al. relataram recentemente que a t-bet sofre degradação proteasómica mediada pela ubiquitinação durante as fases posteriores da diferenciação celular Th1 . Dos 16 resíduos de lisina presentes na proteína t-bet do Ratinho, 11 estão predominantemente localizados no domínio t-box, e os restantes 5 estão localizados no terminal carboxílico (resíduos 326 a 530), enquanto que não estão presentes resíduos de lisina no amino-terminal (resíduos 1 a 134). Curiosamente, os resíduos de lisina dentro do domínio t-box são preferencialmente ubiquitados após a sobre-expressão da ubiquitina. Uma análise mais aprofundada identificou que a mutação da lisina 313 (K313) diminui a degradação da t-bet mediada pela ubiquitinação e aumenta o nível de expressão da t-bet no núcleo e no citoplasma. Apesar dos níveis aumentados do mutante K313, esta mutação revogou completamente as funções T-bet envolvendo ligação ao ADN, activação transcritional do IFNG e supressão da produção de citocinas IL-2 e Th2. A estrutura cristalina das α-hélices do domínio t-box ligado ao ADN sugere fortemente que o grupo amino de K313 está associado ao fosfato de uma base de ADN através da interacção ligação hidrogénio-hidrogénio. Além disso, a mutação de K313 também leva à falha na supressão da produção de IL-2 e Th2 de citocina; no entanto, a interação e supressão de GATA-3 e NF-kB p65 não são alteradas pela mutação de K313. Curiosamente, a interação NFAT é abolida em t-bet mutante K313, que também está fortemente associada com a ausência de fosforilação em T302. Ainda não está claro se e como K313 regula a fosforilação T302 e vice-versa.

5. T-Bet em doenças inflamatórias e auto-imunes

desde Mosmann et al. descobriu Th1 e Th2 subconjuntos que produzem assinatura de citocinas IFN-γ e IL-4, IL-5 e IL-13, respectivamente, e que modulam a inflamatórias e alérgicas respostas imunes , outros estudos identificaram romance de subconjuntos de células Th, como Th17, TFH, e células Treg . Estudos extensivos também caracterizaram as vias sinalizadoras da citocina e os fatores de transcrição envolvidos na regulação das respostas imunitárias aos patógenos . Importante, T-bet desempenha um papel fundamental no controle da diferenciação de vários subconjuntos de Th células e na modulação de doenças inflamatórias e auto-imunes .

T-Bet também funciona como um regulador antiastmático. Uma deficiência em T-bet, espontaneamente, leva ao desenvolvimento de sintomas asmáticos, que é caracterizado pelo aumento da infiltração de eosinófilos nas vias aéreas, muco-secretoras hiperplasia de células caliciformes, crônica e remodelamento das vias aéreas com colágeno acumulação e proliferativa miofibroblastos; esses recursos muitas vezes são vistos também em pacientes asmáticos . A restauração da expressão T-bet altera o equilíbrio imunológico para uma resposta Th1 e previne e atenua a inflamação patológica pulmonar in vivo .Além disso, o T-bet está protegido contra infecções intracelulares patogénicas. Revogação de T-bet-induzida produção de IFN-γ resultou em maior suscetibilidade a patógenos intracelulares in vivo, incluindo o Mycobacterium tuberculosis, Leishmania major, e Salmonella typhimurium , enfatizando a importância da produção de IFN-γ por T-bet-expressando Th1 células na defesa contra infecções bacterianas. No entanto, os ratos com deficiência em T-bet são resistentes à infecção por Listeria monocytogenes, porque a produção INF-γ Por células assassinas naturais é necessária e suficiente para a defesa do hospedeiro contra L. monocytogenes .

Além disso, o T-bet pode agravar o desenvolvimento de processos inflamatórios e doenças auto-imunes, incluindo doença inflamatória do intestino, experimental encefalomielite auto-imunes, inflamatórias, artrite e diabetes tipo I, como essas doenças inflamatórias são atenuados na ausência de T-bet . Estes achados sugerem que a afinação fina da resposta imunitária por modulação da expressão T-bet pode ter efeitos benéficos para pacientes com asma crônica, doença inflamatória intestinal, artrite, esclerose múltipla, e diabetes.

6. Conclusões e Perspectivas

T-bet ” é uma caixa-T de domínio contendo fator de transcrição que normalmente é envolvido no desenvolvimento de legislação, mas exerce múltiplas funções no dia a diferenciação celular; transcrição de ativação de IFN-γ-expressão de células Th1, indiretos supressão de Th2, Th17 e desenvolvimento de células Treg, e multa-modulação de IL-2 produção de células Th1. Esta multitasking não é surpreendente, pois a T-bet sofre várias modificações pós-transferacionais. Fosforilação em Y525 desempenha um papel na GATA-3 supressão durante Th2 regulamento, fosforilação em S508 faz com NF-kB p65 supressão no contexto de IL-2 regulamento em células Th1, fosforilação em T302 desempenha um papel no aperfeiçoamento de IL-2 produção, e ubiquitination em K313 desempenha um papel importante no controle de T-bet de proteína de estabilidade. Assim, a modificação pós-transferacional do T-bet facilita a sua diversidade funcional e a complexidade da sua modulação da expressão citocina (Figura 2). Não é conhecido se a vários posttranslational modificações ocorrem sequencialmente ou simultaneamente, se um tipo de proteína modificação afeta outra modificação, ou se as mudanças na posttranslational modificação de T-bet estão relacionados com o desenvolvimento de infecções e doenças inflamatórias crônicas. Uma maior identificação de novas modificações de proteínas relacionadas com as funções T-bet forneceria informações valiosas sobre o desenvolvimento de poderosas intervenções terapêuticas para o controle de doenças inflamatórias crônicas e autoimunes.

Figura 2

múltiplas funções T-bet desempenhando um papel na diferenciação de células Th. A indução da expressão T-bet através da ativação do STAT1 e do STAT4 estimula diretamente a transcrição de genes contendo elementos de ligação T-box, tais como IFNG, IL12RB2 e CXCR3, aumentando assim o desenvolvimento de células Th1. A T-Bet sofre fosforilação de serina em S508 e, em seguida, reduz a produção de IL-2 nas células Th1, recrutando p65 NF-kB do promotor IL2. Os níveis proteicos da t-bet nas células Th1 podem ser controlados pela via de degradação proteosómica mediada pela ubiquitina. Além disso, o T-bet proteína sofre adicionais posttranslational modificações, por exemplo, fosforilação em T302 e Y525, o que facilita a sua supressão da produção de citocina Th2 que é induzida pela ativação do NFAT e GATA-3.

Lista de Abreviaturas

conflito de interesses

não foi revelado qualquer potencial conflito de interesses.

reconhecimento

este trabalho foi apoiado pelo Programa de pesquisa de meio de carreira através do NRF Grant (2013R1A2A2A01068302).