Timeless TCID50: One solution to many viruses
This month we cover an old classic, The Tissue Culture Infectious Dose 50, or TCID50. O ensaio TCID50 é utilizado para quantificar os títulos virais determinando a concentração à qual 50% das células infectadas apresentam efeito citopático (EPC). Enquanto o vírus de interesse causar a morte celular, este teste tem a vantagem de ser barato e fácil de implementar também quando anticorpos específicos do vírus não estão disponíveis. Na verdade, é necessária muito pouca informação sobre o vírus em si, tornando-o uma ferramenta-chave para estudar patógenos novos e emergentes.Teste TCID50: o que é e como usá-lo
num ensaio TCID50, diluições em série de um vírus são adicionadas a monocamadoras de células e deixadas até que a EPC possa ser vista. Neste ponto, o efeito da diluição em série sobre as células pode ser medido de forma descontínua ou contínua. De forma descontínua, a diluição única a que 50% das células apresentam EPC é utilizada para quantificar aproximadamente a quantidade de vírus presente na reserva original. Isto é bastante simples e não requer uma análise mais aprofundada. No entanto, também vem com um grau de imprecisão, uma vez que não permite distinguir com precisão dentro da mesma diluição.
informações mais precisas podem ser obtidas de forma contínua usando uma leitura colorimétrica, e.g. um substrato metabólico com absorvância específica, em que a quantidade de sinal adquirido é proporcional ao número de células vivas. Os valores de absorvância das diferentes diluições podem então ser traçados numa curva de resposta dose-resposta de regressão não linear contínua, a partir da qual será possível extrapolar valores de TC50 mais precisos. O método descontínuo é suficiente se não for necessário um título preciso, ou para determinar que concentração de vírus é necessária para obter uma determinada percentagem de infecção em testes a jusante (uma vantagem do TCID50 é que pode ser realizada na linha celular de interesse, desde que o vírus cause CPE). No entanto, mesmo nestes casos, pode ser melhor usar diluições dobras entre 1: 2 e 1: 5 para melhorar a precisão. Quando, em vez disso, é necessária uma quantificação mais precisa, por exemplo, ao comparar o efeito de diferentes tratamentos ou mutações nos títulos de vírus, pode ser preferível um método colorimétrico.Os valores de TCID50 dão uma indicação da quantidade de vírus necessária para ter EPC em 50% das células. Mas como passar disto para a quantidade real de vírus por ml? A fórmula é bastante simples, e consiste em multiplicar o valor TCID50 por 0,7. Isto vem da distribuição de Poisson aplicada à infecção viral que afirma que, em uma linha celular totalmente permissiva, a probabilidade de atingir 50% de infecção é alcançada por uma multiplicidade de infecção de aproximadamente 0,7. Isso nem sempre é verdade, mas é uma boa aproximação para a maioria das aplicações.
the troubles of counting viruses
As accurate as one can be, counting viruses is never easy. Em primeiro lugar, as diluições em série São-pela sua própria natureza – uma fonte de erro. Em segundo lugar – e isto é particularmente relevante para títulos elevados de vírus-mesmo o menor volume que permanece ligado ao fim de uma ponta de pipeta pode transportar partículas virais suficientes para fazer uma diferença substancial na quantificação. Em terceiro lugar, a variação biológica do sistema é alta. Placa a mesma quantidade de células, adicionar a mesma quantidade de vírus, parar a infecção ao mesmo tempo, e a porcentagem de infecção pode estar perto, mas nunca exatamente o mesmo.Finalmente, ao avaliar um tratamento que (como você esperaria!) diminui os títulos de vírus, a quantidade de vírus pode descer abaixo do limiar de detecção do doseamento.
A arte de contar vírus
A boa notícia é que uma vez que você sabe seus problemas você não está longe de uma solução! A precisão na diluição em série pode ser reduzida pela automatização, mas mesmo quando esta não está disponível, algumas pequenas pontas podem fazer a diferença. Estas incluem a mudança de pontas de pipeta e nunca inserir uma ponta de pipeta mais profunda do que um milímetro na diluição seguinte, para evitar acidentalmente transportar alguns troncos extra de vírus que acabaram de ficar presos no plástico exterior. As réplicas também são importantes, e quanto mais para os ensaios miniaturizados. 96 as placas de poços permitem o manuseamento simultâneo de várias amostras de uma forma que métodos de baixa capacidade (como o ensaio em placas) não permitiriam, mas vêm com variabilidade adicional, uma vez que os pequenos volumes são ainda mais sensíveis às questões discutidas acima. Enquanto as réplicas técnicas vão de alguma forma para resolver isso, no VRS tentamos executar experimentos que irão requerer um TCID50 colorimétrico em triplicado biológico. Isto aumenta a robustez da abordagem e permite excluir pontos espúrias no conjunto de dados sem perder significado. Os valores precisos de TC50 exigirão uma resposta de regressão não linear dos dados colorimétricos, que programas como o Prism GraphPad podem facilmente gerar. No entanto, a capacidade de qualquer software para traçar este tipo de curva dependerá estritamente da qualidade dos dados, e dos valores numéricos próximos dos replicados. Uma inspeção visual das curvas e dos valores de TC50 gerados é altamente recomendada para corrigir situações em que a extrapolação foi distorcida por pontos de dados espúrias. Acima de tudo, nossa experiência sugere que, além das titulações padrão de estoque de vírus, experimentos que necessitarão de leitura TCID50 podem precisar de etapas adicionais de otimização, tanto para determinar as melhores condições biológicas que garantirão a coleta a montante de quantidades reprodutíveis de vírus (e.g. linha celular de escolha, Formato da placa, multiplicidade de infecções, pontos temporais) e a melhor gama de concentrações a testar no ensaio TCID50 (por exemplo, concentração inicial e dobra de diluição).Morte celular ou belas fotos?
Contagem de células mortas não é fácil, pois muitas vezes eles abandonam a placa na primeira lavagem-supondo que eles ainda estão lá em primeiro lugar! Isto não ajuda com a precisão. Embora mais caro e laborioso, sempre que um bom anticorpo está disponível, a coloração da imunofluorescência é a abordagem que geralmente escolheríamos. O ensaio pode ser interrompido antes da morte celular e a sensibilidade é geralmente mais elevada, o que permite maior controlo e maior precisão. Além disso, este método pode ser usado para vírus que não causam CPE, ou que levam muito tempo para fazê-lo (e vamos enfrentá-lo, algumas fotos agradáveis de um vírus em ação são muito mais edificantes!). O dano celular, no entanto, é a marca registrada da maioria das infecções e de vários vírus emergentes dos quais sabemos muito pouco. Vários repórteres colorimétricos / fluorescentes estão agora disponíveis para medir de forma sensível e distinguir entre diferentes tipos de citotoxicidade. Parece que este velho clássico está pronto para novos desafios!