Expresie îmbunătățită a ARNm PEPCK
izoforma citosolică a PEPCK este un loc principal de reglare a gluconeogenezei hepatice și renale (71). Cu toate acestea, această activitate nu este reglementată de mecanisme alosterice sau de modificări covalente. În schimb, este reglementată exclusiv de mecanisme care determină nivelul ARNm PEPCK și, prin urmare, controlează nivelul proteinei PEPCK. Acest lucru se realizează prin modificări fie ale ratei de sinteză, fie ale ratei de degradare a ARNm PEPCK. Gena PCK1 care codifică PEPCK citosolic este compusă din 10 exoni și 9 introni și are o lungime de aproximativ 6 kb (13). Codifică un singur ARNm de 2,6 kb care este tradus într-o proteină care conține 621 aminoacizi și are o masă de 69.300 Da. Nivelul ARNm PEPCK la rinichi de șobolan este crescut rapid după debutul acut al acidozei (80). Creșterea este inițiată în decurs de 1 oră și atinge un maxim în decurs de 7 ore la un nivel de șase ori mai mare decât în mod normal. Experimentele de transcriere (80) au indicat că modificările ratei relative de transcriere a genei PCK1 reprezintă inducerea inițială a ARNm PEPCK. Mai mult, modificările observate ale nivelurilor de ARNm PEPCK s-au corelat strâns cu datele anterioare care au măsurat modificările ratelor relative ale sintezei proteinelor PEPCK la șobolani normali și acidotici (84). Cu toate acestea, nivelul indus de șase ori al ARNm PEPCK este susținut la șobolanii care sunt acidotici cronic, chiar dacă rata relativă de transcriere scade treptat și platourile la un nivel care este doar dublu mai mare decât cel observat la șobolanii normali (81).
diferite segmente ale promotorului PEPCK, precum și promotorul de bază (-460 până la +73 bp) care conțin mutații bloc specifice în elementele de reglementare au fost analizate pe larg la animalele transgenice pentru a determina rolul lor în controlul expresiei genei PCK1 (72). Promotorul nucleului wildtype fuzionat cu gena hormonului de creștere bovin (bGH) conține toate informațiile necesare pentru a asigura o expresie adecvată și o reglare hormonală în ficat. Un segment mai mare de 2,3 kb al promotorului PEPCK a fost necesar pentru a conduce expresia transgenei în țesutul adipos. Cu toate acestea, ambele construcții au fost exprimate la niveluri scăzute în rinichi. În schimb, o transgenă CRC362 care conține doar 362 bp din Promotor, dar toți exonii și intronii din aval ai genei pck1 de șobolan a fost exprimată la niveluri normale în rinichi (40). Această transgenă diferă de gena endogenă numai prin înlocuirea unui segment al genei pck1 de pui în porțiunea exonului final care codifică 3′-UTR al ARNm PEPCK. Mai mult, această din urmă construcție prezintă o inducție renală specifică semnificativă atunci când șoarecii transgenici au fost făcuți acidotici (20).
celulele LLC-PK1-F+ prezintă o inducție receptivă la pH a ARNm PEPCK (64). Încercările anterioare de a identifica un element receptiv la pH prin expresia tranzitorie a diferitelor construcții reporter PEPCK-cloramfenicol acetiltransferază în celulele LLC-PK1-F+ au produs rezultate contradictorii (21, 77). Cu toate acestea, aceste studii au stabilit în mod clar că legarea HNF-1 de elementul P2 este esențială pentru exprimarea bazală a PEPCK renal și că această interacțiune proteină-ADN poate contribui la creșterea expresiei în timpul acidozei. Construcțiile de luciferază care conțin fie 490, fie 2300 bp ale promotorului PEPCK sunt puternic activate prin cotransfecția celulelor LLC-PK1-F+ cu subunitatea catalitică a protein kinazei A (112). Cu toate acestea, niciuna dintre constructe nu prezintă o activitate crescută atunci când celulele transfectate au fost transferate în mediu acid (pH 6,9, 10 mM HCO−3) (Wall Q și colab., date nepublicate, 1999). Această observație și constatarea că o transgenă care conține doar 362 bp de promotor împreună cu exonii și intronii din aval este suficientă pentru a recapitula inducția receptivă la pH (20) sugerează că gena PEPCK poate conține un element din aval care este esențial pentru creșterea receptivă la pH a transcripției. Alte experimente au stabilit că C / EBP (112) și ATF-2 (44) se leagă de elementul CRE-1 al genei PEPCK în rinichi.
studiile anterioare au demonstrat, de asemenea, că timpul de înjumătățire plasmatică al ARNm PEPCK este crescut în ficat ca răspuns la amp (76) și glucocorticoizi (132). Creșterea stabilității poate contribui, de asemenea, la inducerea susținută a ARNm pepck renal în timpul acidozei cronice (81). Prin urmare, stabilizarea selectivă a ARNm poate juca, de asemenea, un rol important în reglarea fiziologică a expresiei genei PEPCK. Sistemul promotor care răspunde la tetraciclină a fost utilizat pentru a cuantifica timpul de înjumătățire al diferitelor ARNm himerice de tip in-PK1-F+ (67).
ARNm-ul de la clasa a VIII-a-PCK-1, care conține întregul 3′ – UTR al ARNm-ului PEPCK, a fost degradat cu un timp de înjumătățire de 1,2 ore. Tratamentul cu RNase H a indicat că deadenilarea rapidă s-a produs concomitent cu degradarea ARNm-ului de la ingustg-PCK-1. Studiile anterioare (108) au indicat faptul că PCK-7, un segment de 50-nt la capătul 3’al 3′-UTR, leagă o proteină neidentificată care poate contribui la descompunerea rapidă a ARNm PEPCK. Cu toate acestea, ARNm-ul himeric de la ingg-PCK-7 are un timp de înjumătățire de 17 ore. Includerea segmentului PCK-6 adiacent, o regiune bogată în UA de 23 bp, a produs ARNm-ul de la 7/7 care are un timp de înjumătățire de 3,6 ore. ARNm-ul de la clasa a VIII-a-PCK – 3 care conține 3′-jumătate din 3′-UTR a fost degradat cu același timp de înjumătățire. În mod surprinzător, ARNm-ul de la 7g-PCK-2, care conține capătul 5’al 3′-UTR, a fost, de asemenea, degradat rapid (t1/2 = 5,4 ore). Analizele de schimbare a gelului ARN au stabilit că auf1 se leagă de segmentele PCK-7, PCK-6 și PCK-2 cu afinitate și specificitate ridicate. Analiza mutațională indică faptul că auf1 se leagă de o secvență UUAU-UUUAU în cadrul PCK-6 și o structură stem-buclă și o regiune adiacentă cu a PCK-7. Astfel, AUF1 se leagă de mai multe elemente destabilizatoare din cadrul 3′ -UTR care participă la cifra de afaceri rapidă a ARNm PEPCK. Experimentele mai recente indică faptul că segmentul PCK-7 leagă, de asemenea, cristalina/NADPH: chinonă reductază cu afinitate și specificitate ridicată (hajarnis și Curthoys, date nepublicate, 2006). Astfel, același mecanism care explică inducerea mai treptată a ARNm GA și GDH poate contribui, de asemenea, la creșterea susținută a nivelurilor de ARNm PEPCK în timpul acidozei cronice.