utvecklingen och gradvisa förbättringar av jäst-tvåhybridsystemet (Y2H) sedan början av 90-talet revolutionerade hur proteininteraktioner kunde detekteras1.
jäst tvåhybrid baseras på rekonstituering av en funktionell transkriptionsfaktor (TF) när två proteiner eller polypeptider av intresse interagerar. Detta sker i genetiskt modifierade jäststammar, där transkriptionen av en reportergen leder till en specifik fenotyp, vanligtvis tillväxt på ett selektivt medium eller förändring i jästkoloniernas färg. De mest populära reportergenerna är HIS3 för att välja jäst på ett medium som saknar histidin och LacZ för att screena jäst i en kolorimetrisk analys.
de tekniska detaljerna för en jäst-Tvåhybridanalys beskrivs i tecknet nedan.
två fusioner (’hybrider’) konstrueras mellan varje protein av intresse och antingen DNA-Bindningsdomänen (DBD) eller Aktiveringsdomänen (AD) för TF. Proteinet smält till DBD kallas ’bete’, och proteinet smält till AD som ’byte’.
vid interaktion mellan betet och bytet bringas DBD och AD i närheten och en funktionell TF rekonstitueras uppströms om reportergenen. De mest populära fusionerna använder DBD och AD av jäst TF Gal4. Bakterieproteinet LexA används också ofta som en DBD i kombination med Gal4 AD.
som en genetisk teknik erbjuder en jäst-tvåhybridskärm ett känsligt och kostnadseffektivt medel för att testa den direkta interaktionen mellan två riktade proteiner, eller att använda sitt favoritprotein som bete för att screena bibliotek av proteinfragment framställda från önskade celltyper, vävnader eller hela organismer. Identiteten hos de interagerande partnerna erhålls sedan genom sekvensering av motsvarande plasmider i de valda jästkolonierna. Samlingar av fullängdsproteiner (’ORFeomes’) blir också tillgängliga för flera arter, men de täcker inte hela proteomet ännu.
jäst-tvåhybridsystemet antogs snabbt av det vetenskapliga samfundet och skärmar inom olika arter och forskningsområden ledde redan till dussintals tusentals publikationer. Det är fortfarande den metod som valts när det gäller att upptäcka nya proteininteraktioner, vilket återspeglas av den nyligen publicerade litteraturen.
variationer av Y2H utvecklades för att genomföra skärmar i närvaro av en kofaktor eller ett enzym som krävs för en given post-translationell modifiering av proteinpartnern2.
andra versioner tillåter att screena integrerade membranproteiner3 och tekniken anpassades för att detektera protein-proteininteraktioner i däggdjursceller4. Slutligen utformades även jäst-n-hybridprotokoll för att screena för nya DNA-protein5, RNA-protein6 och små molekyl-proteininteraktioner 7.
Upptäck Hybrigenics senaste optimerade jäst två-Hybrid skärm tjänst: ULTImate Y2H.
kontakta våra forskargrupper för gratis råd om ditt projekt.
1. Fält, S. Och Song, O. ett nytt genetiskt system för att detektera protein-proteininteraktioner (1989) Nature 340, 245-246
2. Naba, A., Reverdy, C., Louvard, D. och Arpin, M. rumslig rekrytering och aktivering av Fes-kinas av ezrin främjar HGF-inducerad cellspridning (2008) EMBO J. 27(1), 38-50
3. Stagljar, I., Korostensky, C., Johnsson, N. och te Heesen, S. Ett genetiskt system baserat på split-ubiquitin för analys av interaktioner mellan membranproteiner in vivo (1998) PNAS 95(9), 5187-5192
4. Eyckerman, S., Verhee, A., der Heyden, Jv, Lemmens, I., Ostade, XV, Vandekerckhove, J. och Tavernier, J. Design och tillämpning av en cytokinreceptorbaserad interaktionsfälla (2001) Nat-Cell Biol. 3(12), 1114-1119
5. Li, JJ och Herskowitz, I. isolering av ORC6, en komponent i yeast origin recognition complex av ett enhybridsystem (1993) vetenskap 262(5141), 1870-1874
6. Putz, U., Skehel, P. och Kuhl, D. Ett tri-hybridsystem för analys och detektion av RNA-protein interaktioner (1996) nukleinsyror Res 24, 4838-4840
7. Licitra, Ej och Liu, Jo ett trehybridsystem för detektering av små ligandprotein
receptorinteraktioner (1996) PNAS 93( 23), 12817-12821