5.3 miRNA-medierad reglering av mål
inom RISC interagerar miRNA med målgener via basparning. Interaktionen mellan en miRNA och dess mål mRNA är begränsad till 5′ slutet av miRNA. Sekvenskomplementaritet mellan nukleotider 2-8, även känd som ”fröregionen”, är avgörande för målsekvensigenkänning, även om undantag från denna regel har visats . Oftast är miRNA-bindningsställen närvarande i den 3′-oöversatta regionen (UTR) av mål-mRNA, vanligtvis i flera kopior . MiRNA har emellertid också visats rikta sig mot 5 ’ – UTR och kodande regioner av mRNA . En studie av Tay et al. visat att ett nätverk av miRNA kan binda till flera platser inom kodningen och 3’-UTR av ett enda mRNA-mål, vilket ökar komplexiteten hos miRNA-medierad målreglering . Graden av komplementaritet mellan fröområdet i miRNA och bindningsstället i mål-mRNA bestämmer mekanismen genom vilken miRNA reglerar målet . Om miRNA blottar tillräcklig sekvenskomplementaritet (nära perfekt) till målet mRNA, utförs reglering genom en process som kallas RNA-interferens, varigenom RISC riktas för att klyva målet mRNA . Om det inte finns tillräcklig komplementaritet , vilket i allmänhet är fallet hos däggdjur, uppnås reglering genom förtryck av översättning och/eller destabilisering av mRNA .
kärnkomponenterna i RISC är Argonaute (Ago) – familjen av proteiner, som spelar en nyckelroll i dess funktion . Alla fyra däggdjursproteiner sedan (Ago1-Ago4) kan styra translationell förtryck av ett mål mRNA, men endast Ago2 har ”slicer” – aktivitet och är ansvarig för att klyva mål mRNA . Den exakta mekanismen för miRNA-medierad translationell förtryck av målgener är fortfarande osäker . Flera studier har visat att translationell förtryck sker före initiering av översättning . Andra studier tyder dock på att förtryck sker efter initiering av översättning . Man trodde ursprungligen att miRNA-medierad förtryck av målgener huvudsakligen återspeglades på proteinnivån, utan eller minimal effekt på mRNA-nivåer. Det har emellertid nu visats att miRNA-medierad förtryck av målgener ofta är associerad med destabilisering av mRNA, även om det inte är känt om detta är en sekundär effekt av translationell förtryck. miRNA-medierad nedbrytning av mRNA-mål involverar deadenylering (avlägsnande av Poly a-svansen), följt av decapping och exonukleolytisk digestion . Dessutom anses bearbetningsorgan (P-kroppar), cytoplasmatiska strukturer som är involverade i lagring och nedbrytning av mRNA, också spela en roll i miRNA-reglering . miRNA tros vägleda uppsätta som mål mRNA och tillhörande RISC-proteiner till dessa lagringsstrukturer, som berikas för mRNA-degradering och translational repression dela upp i faktorer . Mekanismerna som dikterar om ett mål mRNA följer nedbrytnings-eller translationell förtrycksväg är för närvarande okända. Att lägga till komplexiteten hos miRNA-medierad reglering är de senaste upptäckterna att under olika stressförhållanden kan miRNA-inducerad förtryck av mål vändas och att miRNA kan aktivera översättning av mål-mRNA .
miRNA-medierad reglering verkar vara en extremt dynamisk process, dess komplexitet ökas av det faktum att perfekt komplimang till målet inte krävs för reglering. Detta indikerar att en enda miRNA har potential att reglera flera målgener. Dessutom kan ett nätverk av miRNA fungera samtidigt för att reglera ett enda mRNA. Detta gör slutligen i silico-identifiering av målgener och belysningen av miRNA-funktionen mycket svårare.
fröområdet, beläget vid positionerna 2-7 från 5′ – änden av miRNA, används av RISC som en kärnbildningssignal för att känna igen mål-mRNA . På mRNA kallas motsvarande platser som”fröplatser”. Det finns ett antal strängar associerade med målfrösigenkänning och bindning . En sträng fröplats har perfekt Watson-Crick-bindning och kan delas in i fyra ”frö”-typer: 8mer, 7mer-m8, 7mer-A1 och 6mer . Var och en av dessa typer skiljer sig beroende på kombinationen av nukleotiden i position 1 och parning vid position 8. 8mer har både ett adenin vid position 1 på mRNA-målplatsen och basparning vid position 8. Ett adenin på målplatsen som motsvarar position 1 i ett miRNA är känt för att öka effektiviteten för måligenkänning . 7mer-A1 har endast en adenin vid position 1, medan 7mer-m8 endast har basparning vid position 8. Däremot har 6mer varken adenin vid position 1 eller basparning vid position 8 .
förutom stringent fröigenkänning är måttligt stringent erkännande också möjligt, eftersom RISC kan tolerera små felaktigheter eller wobble parning inom fröområdet. Den termodynamiska stabiliteten hos en wobble–parning (som G:U) är jämförbar med den för en Watson-Crick-parning .
Watson–Crick-parning i 3′ – delen av miRNA-molekylen är känd för att förbättra platsigenkänningseffektiviteten i miRNA-mål som har fröparning . Det föredragna nukleotidantalet matchningar i 3 ’ -delen skiljer sig mellan den plats som har sträng fröparning och den som har måttlig sträng fröparning . Stränga frön kräver 3-4 matcher i positionerna 13-16, medan måttliga stränga frön kräver 4-5 matcher i positionerna 13-19. Webbplatser med denna ytterligare 3′ parning kallas 3-kompletterande och 3’ kompensations platser .
det har i stor utsträckning visats att den stora majoriteten av miRNA-måligenkänningssekvenser finns i 3′-UTR av målgenen, även om miRNA-laddad RISC i teorin kan binda något segment av mRNA. Målgener har i allmänhet längre 3 ’UTR, medan vissa allestädes närvarande gener, såsom hushållande gener, tenderar att ha kort 3’ UTR, potentiellt för att undvika att regleras av miRNA . Mål platser är inte jämnt fördelade med 3 ’ UTR. De ligger nära båda ändarna på lång 3 ’ UTR(i allmänhet 2000 xnumx xnumx xnumx nt). För kortare 3 ’ UTR tenderar målplatser att vara ~15-20 nt bort från stoppkodonet .
även om det allmänt anses att funktionella miRNA-platser företrädesvis finns i 3′ UTR, kan fröplatser i kodningssekvensen och 5′ utr-regioner också främja mRNA-nedreglering . Grunden för preferentiell miRNA-bindning i 3′ UTR kan ha ett antal förklaringar. Till exempel kan RISC behöva konkurrera med andra proteinkomplex, såsom ribosomer, bindning till kodande sekvens och translationsinitieringskomplex i 5′ UTR. Som sådan kan 3 ’ UTR helt enkelt vara mer tillgänglig för långsiktig bindning än de andra två platserna .