Timeless TCID50: Una solución para muchos virus
Este mes cubrimos un clásico antiguo, el ensayo de Dosis infecciosa de Cultivo de tejidos 50, o TCID50. El ensayo TCID50 se utiliza para cuantificar los títulos virales determinando la concentración a la que el 50% de las células infectadas muestran efecto citopático (EPC). Mientras el virus de interés cause la muerte celular, este ensayo tiene la ventaja de ser barato y fácil de implementar también cuando no se dispone de anticuerpos específicos del virus. De hecho, se requiere muy poca información sobre el virus en sí, lo que lo convierte en una herramienta clave para estudiar patógenos nuevos y emergentes.
TCID50 ensayo: ¿qué es y cómo usarlo
En un TCID50 de ensayo, diluciones seriadas de un virus se agregan en monocapas de células, y se deja hasta CPE puede ser visto. En este punto, el efecto de la dilución en serie sobre las células puede puntuarse de manera discontinua o continua. De manera discontinua, la dilución única en la que el 50% de las células muestran EPC se utiliza para cuantificar aproximadamente la cantidad de virus presente en el material original. Esto es bastante sencillo y no requiere más análisis. Sin embargo, también viene con un grado de inexactitud, ya que no permite distinguir con precisión dentro de la misma dilución.
Se puede obtener información más precisa de forma continua utilizando una lectura colorimétrica, p. ej. sustrato metabólico con absorbancia específica, donde la cantidad de señal adquirida es proporcional al número de células vivas. Los valores de absorbancia de las diferentes diluciones se pueden trazar en una curva de regresión dosis-respuesta no lineal continua, a partir de la cual será posible extrapolar valores TC50 más precisos. El método discontinuo es suficiente si no se requiere un título preciso, o para determinar qué concentración de virus se necesita para obtener un cierto porcentaje de infección en ensayos posteriores (una ventaja de la DICT50 es que se puede realizar en la línea celular de interés, siempre que el virus cause EPC). Sin embargo, incluso en estos casos, puede ser mejor usar pliegues de diluciones entre 1:2 y 1:5 para mejorar la precisión. En cambio, cuando se necesita una cuantificación más precisa, por ejemplo, al comparar el efecto de diferentes tratamientos o mutaciones en los títulos de virus, se puede preferir un método colorimétrico.
De diluciones a títulos
Los valores de DICT50 dan una indicación de cuántos virus se necesitan para tener EPC en el 50% de las células. Pero, ¿cómo pasar de esto a la cantidad real de virus por ml? La fórmula es bastante simple, y consiste en multiplicar el valor TCID50 por 0,7. Esto proviene de la distribución de Poisson aplicada a la infección viral que afirma que, en una línea celular totalmente permisiva, la probabilidad de alcanzar el 50% de infección se logra por una multiplicidad de infección de aproximadamente 0,7. Esto no siempre es cierto, pero es una buena aproximación para la mayoría de las aplicaciones.
Los problemas de contar virus
Con la mayor precisión posible, contar virus nunca es fácil. En primer lugar, las diluciones en serie son, por su propia naturaleza, una fuente de error. En segundo lugar, y esto es particularmente relevante para títulos altos de virus, incluso el volumen más pequeño que permanece unido al extremo de la punta de una pipeta puede transportar suficientes partículas virales para marcar una diferencia sustancial en la cuantificación. En tercer lugar, la variación biológica del sistema es alta. Coloque la misma cantidad de células, agregue la misma cantidad de virus, detenga la infección al mismo tiempo y el porcentaje de infección puede ser cercano, pero nunca exactamente el mismo.
Finalmente, al evaluar un tratamiento que (¡como es de esperar!) disminuye los títulos de virus, la cantidad de virus puede caer por debajo del umbral de detección del ensayo.
El arte de contar virus
¡La buena noticia es que una vez que conoce sus problemas, no está lejos de una solución! La precisión en la dilución en serie se puede reducir mediante la automatización, pero incluso cuando esto no está disponible, algunas puntas pequeñas pueden marcar la diferencia. Estos incluyen cambiar las puntas de la pipeta y nunca insertar una punta de pipeta más profunda que un milímetro en la siguiente dilución, para evitar transportar accidentalmente algunos troncos adicionales de virus que se acaban de pegar en el plástico exterior. Las réplicas también son importantes, y más aún para los ensayos miniaturizados. las placas de 96 pocillos permiten el manejo simultáneo de múltiples muestras de una manera que los métodos de rendimiento más bajo (como el ensayo de placa) no permitirían, pero vienen con una variabilidad adicional, ya que los volúmenes pequeños son aún más sensibles a los temas discutidos anteriormente. Si bien las réplicas técnicas abordan esto de alguna manera, en VRS tratamos de ejecutar experimentos que requerirán un TCID50 colorimétrico en triplicado biológico. Esto aumenta la robustez del enfoque y permite excluir puntos espurios en el conjunto de datos sin perder importancia. Los valores precisos de TC50 requerirán una respuesta a la dosis de regresión no lineal de los datos colorimétricos, que programas como GraphPad Prism pueden generar fácilmente. Sin embargo, la capacidad de cualquier software para trazar este tipo de curva dependerá estrictamente de la calidad de los datos y de los valores numéricos cercanos de las réplicas. Una inspección visual de las curvas y los valores TC50 generados es muy recomendable para corregir situaciones en las que la extrapolación ha sido sesgada por puntos de datos falsos. Por encima de todo, nuestra experiencia sugiere que, más allá de las valoraciones estándar de existencias de virus, los experimentos que requerirán la lectura de la DICT50 pueden necesitar pasos adicionales de optimización, tanto para determinar las mejores condiciones biológicas que asegurarán la recolección aguas arriba de cantidades reproducibles de virus (p. ej. línea celular de elección, formato de placa, multiplicidad de infecciones, puntos de tiempo), y el mejor rango de concentraciones para ensayar en el ensayo TCID50 (por ejemplo, concentración inicial y pliegue de dilución).
¿Muerte celular o buenas fotos?
Contar las células muertas no es fácil, ya que muy a menudo abandonan el plato en el primer lavado, ¡se supone que siguen ahí en primer lugar! Esto no ayuda con la precisión. Aunque es más caro y laborioso, siempre que haya un buen anticuerpo disponible, la tinción por inmunofluorescencia es el enfoque que generalmente elegiríamos. El ensayo se puede detener antes de la muerte celular y la sensibilidad es generalmente más alta, lo que permite un mayor control y una mayor precisión. Además, este método se puede usar para virus que no causan EPC, o que tardan mucho tiempo en hacerlo (y seamos sinceros, ¡algunas buenas imágenes de un virus en acción son mucho más edificantes!). El daño celular, sin embargo, es la marca registrada de la mayoría de las infecciones y de varios virus emergentes de los que sabemos muy poco. Varios reporteros colorimétricos / fluorescentes están ahora disponibles para medir con sensibilidad y distinguir entre diferentes tipos de citotoxicidad. Parece que este viejo clásico es para nuevos desafíos!