Vysoce kvalitních sekvenačních dat je důležitou součástí zajištění toho, že vaše údaje jsou spolehlivé a opakovatelné, a získání vysoce kvalitních sekvenačních dat znamená, že pomocí vysoce kvalitní výchozí materiál. Pro RNA-seq dat, to znamená, že pomocí RNA, která má vysokou RIN (RNA Integrity Number), 10-bodové stupnici od 1 – 10, která poskytuje standardizovaný počet výzkumníků indikující kvalitu jejich RNA, odstranění jednotlivých zaujatost a tlumočení z procesu.
Rin je významné zlepšení oproti způsobu, jakým byla dříve vypočtena integrita RNA: poměr 28S a 18S. Protože 28S je přibližně 5 kb a 18 je přibližně 2 kb, ideální 28S:18S poměru 2,7:1–ale benchmark je považován za asi 2:1. Nicméně, toto měření se opírá o předpoklad, že kvalita rRNA (velmi stabilní molekula) je lineárně reflexní mRNA kvality, která je ve skutečnosti mnohem méně stabilní a zkušenosti vyšší obrat .
Obrázek 1: stopy RNA vzorků RNA s různými hodnotami RIN. Všimněte si rozdílu mezi vzorky vysoké a nízké kvality.
naštěstí společnost Agilent Technologies vyvinula lepší metodu: hodnotu RIN. Agilent vyvinul sofistikovaný algoritmus, který vypočítává hodnotu RIN, což je měření, které je výrazným zlepšením v poměru 28S:18S. RIN je zlepšení v tom, že bere v úvahu celistvost RNA vzorek, ne jen rRNA měření, jak můžete vidět na Obrázku 1
význam RNA integrity při určování kvality genové exprese byla zkoumána Chen et al. v roce 2014 porovnáním vzorků RNA 4 různých čísel RIN (od 4.5-9.4) a 3 různých metod přípravy knihovny (poly-a vybrané, vyčerpané rRNA a celková RNA) pro celkem 12 vzorků. Poté vypočítali korelační koeficient genové exprese mezi nejkvalitnější RNA a degradovanějšími vzorky mezi metodami přípravy knihovny.
Obrázek 2: Pouze poly-vybrané RNA knihovna přípravků dojít ke snížení kvality dat s poklesem RIN hodnotu.
Fascinujícím způsobem, pouze knihovna způsobu přípravy, který ukázal výrazné snížení korelace mezi vysokou kvalitou a nízkou kvalitu RNA byla poly-vybrané knihovny způsobu přípravy. Další dvě metody přípravy knihovny měly stále korelační koeficienty vyšší než 0,95 i při nízkých RINs (viz Obrázek 2 )!
Chen et al. se domnívají, že důvodem je to, že degradované vzorky, které jsou poly-vybrané bude mít za následek stále 3′ neobjektivní knihovna přípravy, a proto ztratíte cenné čte ze své údaje. Protože ostatní metody zahrnují buď žádnou léčbu nebo odstranění rRNA (na rozdíl od výběru), bude v celkovém vzorku podstatně menší zkreslení.
I když se zdá, jako by pouze poly-vybrané knihovny metoda přípravy trpí s nízkou RIN, poskytovatelé stále dávají přednost práci s relativně vysokou kvalitou RNA vzorků pro všechny knihovny, metody přípravy. Pokud však máte důležité vzorky, které mají nižší kvalitu RIN, může být vhodné diskutovat o vašich možnostech přímo s poskytovatelem-a my v Genohubu vám rádi pomůžeme usnadnit vaše diskuse! Prosím, kontaktujte nás zde, pokud máte nějaké další dotazy týkající se sekvenování vzorků se špatnou RIN.