Alta qualidade de dados de sequenciamento é uma parte importante para garantir que seus dados é confiável e reproduzível, e a obtenção de uma elevada qualidade de sequenciamento de dados significa usar o alto-qualidade do material de partida. Para os dados RNA-seq, isto significa usar RNA que tem um elevado número de integridade RNA, uma escala de 10 pontos de 1-10 que fornece um número padronizado para os pesquisadores indicando a qualidade de seu RNA, removendo o viés individual e interpretação do processo.
a RIN é uma melhoria significativa em relação à forma como a integridade do RNA foi previamente calculada: a razão 28S e 18S. Porque 28S é aproximadamente 5 kb e 18S é aproximadamente 2 kb, a razão ideal 28S:18S é 2,7:1–mas a referência é considerada cerca de 2:1. No entanto, esta medição baseia-se no pressuposto de que a qualidade do ARNr (uma molécula muito estável) é linearmente reflectora da qualidade do ARNm, que é, na verdade, muito menos estável e apresenta um volume de negócios mais elevado .
Figura 1: vestígios de ARN de amostras de ARN com valores de RIN diferentes. Observe a diferença entre amostras de alta e baixa qualidade.
felizmente, as tecnologias Agilent desenvolveram um método melhor: o valor RIN. Agilent desenvolveu um algoritmo sofisticado que calcula o valor RIN, uma medida que é uma melhoria considerável sobre a razão 28S:18S. Rin é uma melhoria na medida em que leva em conta a totalidade da amostra de RNA, não apenas as medições rRNA, como você pode ver na Figura 1
a importância da integridade do RNA na determinação da qualidade da expressão do gene foi examinada por Chen et al. em 2014, comparando amostras de RNA de 4 diferentes números RIN (de 4.5-9.4) e 3 diferentes métodos de preparação de bibliotecas (poli-a selecionado, rRNA esgotado, e RNA total) para um total de 12 amostras. Eles então calcularam o coeficiente de correlação da expressão do gene entre o RNA de alta qualidade e as amostras mais degradadas entre os métodos de preparação da biblioteca.
Figura 2: apenas as preparações de bibliotecas de RNA seleccionadas de poli-A experimentam uma diminuição na qualidade dos dados com uma diminuição no valor RIN.
fascinantemente, o único método de preparação da biblioteca que mostrou uma diminuição significativa na correlação entre RNA de alta qualidade e RNA de baixa qualidade foi o método poly-a selected library preparation method. Os outros dois métodos de preparação da biblioteca ainda tinham coeficientes de correlação superiores a 0,95 mesmo em RINs Baixos (ver Figura 2 )!Chen et al. teorize que a razão por trás disso é que amostras degradadas que são poli-a selecionadas resultarão em uma preparação de biblioteca cada vez mais parcial de 3′, e que, portanto, você perderá leituras valiosas de seus dados. Como os outros métodos envolvem tanto nenhum tratamento ou remoção rRNA( ao contrário da seleção), haverá consideravelmente menos viés na amostra global.
apesar de parecer que apenas o método de preparação de bibliotecas poli-a selecionado sofre de uma RIN baixa, os provedores ainda preferem trabalhar com amostras de RNA de qualidade relativamente alta para todos os métodos de preparação de bibliotecas. No entanto, se você tem amostras importantes que são de menor qualidade RIN, pode valer a pena ainda discutir suas opções com um provedor diretamente–e nós na Genohub estamos mais do que felizes em ajudar a facilitar suas discussões! Por favor, entre em contato conosco aqui se você tiver mais perguntas sobre sequenciamento de amostras com o pobre RIN.