sekvenseringsdata av hög kvalitet är en viktig del för att säkerställa att dina data är tillförlitliga och replikerbara, och att få sekvenseringsdata av hög kvalitet innebär att man använder högkvalitativt utgångsmaterial. För RNA-seq-data betyder detta att man använder RNA som har ett högt RIN (RNA Integrity Number), en 10-punkts skala från 1 – 10 som ger ett standardiserat tal till forskare som indikerar kvaliteten på deras RNA, vilket tar bort individuell bias och tolkning från processen.
RIN är en signifikant förbättring jämfört med hur RNA-integritet tidigare beräknades: 28S och 18S-förhållandet. Eftersom 28S är ungefär 5 kb och 18S är ungefär 2 kb, är det ideala 28S:18S–förhållandet 2,7:1-men riktmärket anses vara ungefär 2:1. Denna mätning bygger emellertid på antagandet att kvaliteten på rRNA (en mycket stabil molekyl) är linjärt reflekterande av mRNA-kvalitet, vilket faktiskt är mycket mindre stabilt och upplever högre omsättning .
Figur 1: RNA-spår av RNA-prover med olika RIN-värden. Notera skillnaden mellan prover av hög och låg kvalitet.
lyckligtvis har Agilent Technologies utvecklat en bättre metod: RIN-värdet. Agilent har utvecklat en sofistikerad algoritm som beräknar RIN-värdet, en mätning som är en avsevärd förbättring jämfört med 28S:18S-förhållandet. RIN är en förbättring genom att den tar hänsyn till hela RNA-provet, inte bara rRNA-mätningarna, som du kan se i Figur 1
vikten av RNA-integritet vid bestämning av kvaliteten på genuttryck undersöktes av Chen et al. i 2014 genom att jämföra RNA-prover av 4 olika RIN-nummer (från 4.5 – 9.4) och 3 olika biblioteksberedningsmetoder (poly-a selected, rRNA-depleted och total RNA) för totalt 12-prover. De beräknade sedan korrelationskoefficienten för genuttryck mellan RNA av högsta kvalitet och de mer nedbrutna proverna mellan biblioteksberedningsmetoder.
Figur 2: endast poly-a utvalda RNA-biblioteksberedningar upplever en minskning av datakvaliteten med en minskning av RIN-värdet.
fascinerande var den enda biblioteksberedningsmetoden som visade en signifikant minskning av korrelationen mellan högkvalitativt och lågkvalitativt RNA Poly-a-valt biblioteksberedningsmetod. De andra två biblioteksberedningsmetoderna hade fortfarande korrelationskoefficienter större än 0,95 även vid låga RINs (se Figur 2 )!
Chen et al. teoretisera att orsaken bakom detta är att nedbrutna prover som är poly-a valda kommer att resultera i en alltmer 3′ partisk biblioteksberedning, och att du därför kommer att förlora värdefulla läsningar från dina data. Eftersom de andra metoderna involverar antingen ingen behandling eller rRNA-borttagning (i motsats till Urval) kommer det att finnas betydligt mindre förspänning i det totala provet.
även om det verkar som om endast poly-a selected library preparation method lider av att ha en låg RIN, föredrar leverantörer fortfarande att arbeta med relativt högkvalitativa RNA-prover för alla biblioteksberedningsmetoder. Men om du har viktiga prover som är av lägre kvalitet RIN, kan det vara värt att fortfarande diskutera dina alternativ med en leverantör direkt–och vi på Genohub hjälper mer än gärna till att underlätta dina diskussioner! Vänligen kontakta oss här om du har ytterligare frågor om sekvensering av prover med dålig RIN.