a kiváló minőségű szekvenálási adatok fontos részét képezik annak biztosításában, hogy adatai megbízhatóak és replikálhatók legyenek, a kiváló minőségű szekvenálási adatok megszerzése pedig kiváló minőségű kiindulási anyag használatát jelenti. Az RNS-seq adatok esetében ez azt jelenti, hogy magas RIN (RNS Integrity Number) RNS-t használunk, egy 10 pontos skálát 1 – től 10-ig, amely szabványosított számot biztosít a kutatók számára, jelezve RNS-jük minőségét, eltávolítva az egyéni elfogultságot és értelmezést a folyamatból.
a RIN jelentős javulás az RNS integritásának korábban kiszámított módjához képest: a 28S és 18S Arány. Mivel a 28S körülbelül 5 kb, A 18S pedig körülbelül 2 kb, Az ideális 28S:18S Arány 2,7:1–de a referenciaérték körülbelül 2:1. Ez a mérés azonban azon a feltételezésen alapul, hogy az rRNS (egy nagyon stabil molekula) minősége lineárisan tükrözi az mRNS minőségét, amely valójában sokkal kevésbé stabil és nagyobb forgalmat tapasztal .
1.ábra: különböző RIN-értékű RNS-minták RNS-nyomai. Vegye figyelembe a magas és alacsony minőségű minták közötti különbséget.
szerencsére az Agilent Technologies kifejlesztett egy jobb módszert: a RIN értéket. Az Agilent kifejlesztett egy kifinomult algoritmust, amely kiszámítja a RIN értéket, amely mérés jelentős javulást jelent a 28S:18S arányhoz képest. A RIN javulás abban a tekintetben, hogy figyelembe veszi az RNS-minta egészét, nem csak az rRNS-méréseket, amint az az 1.ábrán látható
az RNS integritásának fontosságát a génexpresszió minőségének meghatározásában Chen et al. 2014 – ben 4 különböző RIN-szám (4,5-9,4) és 3 különböző könyvtári előkészítési módszer (poli-a kiválasztott, rRNS-kimerült és teljes RNS) RNS-mintáinak összehasonlításával összesen 12 mintára. Ezután kiszámították a génexpresszió korrelációs együtthatóját a legjobb minőségű RNS és a degradáltabb minták között a könyvtári előkészítési módszerek között.
2.ábra: csak a poli-a kiválasztott RNS könyvtári készítmények tapasztalják az adatminőség csökkenését a RIN érték csökkenésével.
lenyűgöző módon az egyetlen könyvtár-előkészítési módszer, amely szignifikáns csökkenést mutatott a jó minőségű és az alacsony minőségű RNS közötti korrelációban, a poly-a kiválasztott könyvtár-előkészítési módszer volt. A másik két könyvtári előkészítési módszer még alacsony RINs esetén is 0,95-nél nagyobb korrelációs együtthatóval rendelkezett (lásd a 2. ábrát )!
Chen et al. tételezzük fel, hogy ennek oka az, hogy a degradált minták, amelyek poli-a-Val vannak kiválasztva, egyre inkább 3′ elfogult könyvtári előkészítést eredményeznek, ezért értékes olvasmányokat veszít az adataiból. Mivel a többi módszer vagy nem tartalmaz kezelést vagy rRNS eltávolítást (szemben a szelekcióval), lényegesen kevesebb lesz torzítás a teljes mintában.
annak ellenére, hogy úgy tűnik, hogy csak a poli-a kiválasztott könyvtár-előkészítési módszer szenved alacsony RIN-től, a szolgáltatók továbbra is inkább viszonylag jó minőségű RNS-mintákkal dolgoznak az összes könyvtár-előkészítési módszernél. Ha azonban vannak olyan fontos mintái, amelyek alacsonyabb minőségű RIN–t tartalmaznak, akkor érdemes még mindig megvitatni a lehetőségeket közvetlenül a szolgáltatóval-és mi a Genohubnál örömmel segítünk a megbeszélések megkönnyítésében! Kérjük, vegye fel velünk a kapcsolatot itt, ha további kérdése van a gyenge RIN-vel rendelkező minták szekvenálásával kapcsolatban.