datele de secvențiere de înaltă calitate reprezintă o parte importantă a asigurării faptului că datele dvs. sunt fiabile și reproductibile, iar obținerea datelor de secvențiere de înaltă calitate înseamnă utilizarea materialului de pornire de înaltă calitate. Pentru datele ARN-seq, aceasta înseamnă utilizarea ARN care are un Rin ridicat (număr de Integritate ARN), o scară de 10 puncte de la 1 la 10 care oferă un număr standardizat cercetătorilor care indică calitatea ARN-ului lor, eliminând părtinirea și interpretarea individuală din proces.
RIN este o îmbunătățire semnificativă față de modul în care integritatea ARN a fost calculată anterior: raportul 28S și 18S. Deoarece 28S este de aproximativ 5 kb și 18S este de aproximativ 2 kb, raportul ideal 28S:18S este de 2,7:1–dar punctul de referință este considerat aproximativ 2:1. Cu toate acestea, această măsurare se bazează pe presupunerea că calitatea ARNr (o moleculă foarte stabilă) reflectă liniar calitatea ARNm, care este de fapt mult mai puțin stabilă și are o cifră de afaceri mai mare .
Figura 1: urme de ARN ale probelor de ARN cu valori diferite ale RIN. Rețineți diferența dintre probele de înaltă și joasă calitate.
din fericire, Agilent Technologies a dezvoltat o metodă mai bună: valoarea RIN. Agilent a dezvoltat un algoritm sofisticat care calculează valoarea RIN, o măsurare care reprezintă o îmbunătățire considerabilă față de raportul 28S:18S. RIN este o îmbunătățire prin faptul că ia în considerare întregul eșantion de ARN, nu doar măsurătorile ARNr, după cum puteți vedea în Figura 1
importanța integrității ARN în determinarea calității expresiei genice a fost examinată de Chen și colab. în 2014, prin compararea probelor de ARN cu 4 numere RIN diferite (de la 4,5 – 9,4) și 3 metode diferite de preparare a Bibliotecii (Poli-a selectat, ARNr epuizat și ARN total) pentru un total de 12 probe. Apoi au calculat coeficientul de corelație al expresiei genelor între ARN-ul de cea mai înaltă calitate și probele mai degradate între metodele de preparare a Bibliotecii.
Figura 2: numai preparatele bibliotecii ARN selectate Poli-A înregistrează o scădere a calității datelor cu o scădere a valorii RIN.
fascinant, singura metodă de preparare a bibliotecii care a arătat o scădere semnificativă a corelației dintre ARN de înaltă calitate și de calitate scăzută a fost metoda de preparare a Bibliotecii selectate poli-A. Celelalte două metode de pregătire a Bibliotecii aveau încă coeficienți de corelație mai mari de 0,95 chiar și la RINs mici (vezi Figura 2 )!
Chen și colab. teoretizați că motivul din spatele acestui lucru este că probele degradate care sunt selectate Poli-A vor duce la o pregătire din ce în ce mai părtinitoare a bibliotecii 3 și că, prin urmare, veți pierde citiri valoroase din datele dvs. Deoarece celelalte metode nu implică nici un tratament, nici eliminarea ARNr (spre deosebire de selecție), va exista o părtinire considerabil mai mică în eșantionul global.
chiar dacă se pare că doar metoda de pregătire a Bibliotecii selectate Poli-A suferă de un RIN scăzut, furnizorii preferă în continuare să lucreze cu probe de ARN de calitate relativ ridicată pentru toate metodele de pregătire a Bibliotecii. Cu toate acestea, dacă aveți mostre importante de RIN de calitate inferioară, poate merită să discutați în continuare opțiunile dvs. direct cu un furnizor–iar noi, la Genohub, suntem mai mult decât fericiți să vă ajutăm să vă facilitați discuțiile! Vă rugăm să ne contactați aici dacă aveți întrebări suplimentare despre secvențierea probelor cu Rin slab.