Los datos de secuenciación de alta calidad son una parte importante para garantizar que sus datos sean confiables y replicables, y obtener datos de secuenciación de alta calidad significa usar material de partida de alta calidad. Para los datos de ARN-seq, esto significa usar ARN que tiene un alto RIN (Número de Integridad de ARN), una escala de 10 puntos de 1 a 10 que proporciona un número estandarizado a los investigadores que indica la calidad de su ARN, eliminando el sesgo individual y la interpretación del proceso.
La RIN es una mejora significativa sobre la forma en que se calculaba previamente la integridad del ARN: la relación 28S y 18S. Debido a que 28S es de aproximadamente 5 kb y 18S es de aproximadamente 2 kb, la relación ideal de 28S:18S es de 2,7:1, pero el punto de referencia se considera de aproximadamente 2:1. Sin embargo, esta medición se basa en la suposición de que la calidad del ARNr (una molécula muy estable) refleja linealmente la calidad del ARNm, que en realidad es mucho menos estable y experimenta una mayor rotación .
Figura 1: Trazas de ARN de muestras de ARN con diferentes valores de RIN. Tenga en cuenta la diferencia entre muestras de alta y baja calidad.
Afortunadamente, Agilent Technologies ha desarrollado un método mejor: el valor RIN. Agilent ha desarrollado un sofisticado algoritmo que calcula el valor de RIN, una medida que supone una mejora considerable con respecto a la relación 28S:18S. RIN es una mejora, ya que tiene en cuenta la totalidad de la muestra de ARN, no solo las mediciones de ARNr, como se puede ver en la Figura 1
La importancia de la integridad del ARN en la determinación de la calidad de la expresión génica fue examinada por Chen et al. en 2014, al comparar muestras de ARN de 4 números de RIN diferentes (de 4,5 a 9,4) y 3 métodos de preparación de bibliotecas diferentes (seleccionados de poli-A, agotados por ARNr y ARN total) para un total de 12 muestras. Luego calcularon el coeficiente de correlación de expresión génica entre el ARN de mayor calidad y las muestras más degradadas entre los métodos de preparación de la biblioteca.
Figura 2: Solo las preparaciones seleccionadas de ARN poli-A experimentan una disminución en la calidad de los datos con una disminución en el valor de RIN.
Fascinantemente, el único método de preparación de bibliotecas que mostró una disminución significativa en la correlación entre ARN de alta calidad y de baja calidad fue el método de preparación de bibliotecas seleccionadas poly-A. Los otros dos métodos de preparación de la biblioteca aún tenían coeficientes de correlación de más de 0,95 incluso con RINs bajas (ver Figura 2).
Chen et al. teorice que la razón detrás de esto es que las muestras degradadas que son poli-A seleccionadas resultarán en una preparación de biblioteca sesgada de 3′ cada vez más, y que, por lo tanto, perderá lecturas valiosas de sus datos. Debido a que los otros métodos no implican tratamiento o eliminación de ARNr (en lugar de selección), habrá un sesgo considerablemente menor en la muestra general.
A pesar de que parece que solo el método de preparación de la biblioteca seleccionada poly-A sufre de tener una RIN baja, los proveedores aún prefieren trabajar con muestras de ARN de calidad relativamente alta para todos los métodos de preparación de la biblioteca. Sin embargo, si tiene muestras importantes que son de menor calidad RIN, puede que valga la pena seguir discutiendo sus opciones con un proveedor directamente–¡y en Genohub estamos más que encantados de ayudarlo a facilitar sus conversaciones! Póngase en contacto con nosotros aquí si tiene más preguntas sobre la secuenciación de muestras con RIN pobre.