forbedret ekspression af PEPCK mRNA
den cytosoliske isoform af PEPCK er et primært sted for regulering af både hepatisk og renal glukoneogenese (71). Denne aktivitet reguleres imidlertid ikke af allosteriske mekanismer eller ved kovalente modifikationer. I stedet reguleres det udelukkende af mekanismer, der bestemmer niveauet af PEPCK-mRNA ‘ et og derved styrer niveauet af PEPCK-proteinet. Dette opnås gennem ændringer i enten syntesehastigheden eller nedbrydningshastigheden af PEPCK mRNA. Pck1-genet, der koder for det cytosoliske PEPCK, består af 10 eksoner og 9 introner og er cirka 6 kb i længden (13). Det koder for et enkelt 2,6 kb mRNA, der oversættes til et protein, der indeholder 621 aminosyrer og har en masse på 69.300 Da. Niveauet af PEPCK mRNA i rottenyre øges hurtigt efter akut acidose (80). Stigningen initieres inden for 1 time og når et maksimum inden for 7 timer på et niveau, der er seks gange større end normalt. Transkriptionsforløb eksperimenter (80) indikerede, at ændringer i den relative transkriptionshastighed af pck1-genet tegner sig for den indledende induktion af PEPCK mRNA. Desuden var de observerede ændringer i PEPCK mRNA-niveauer tæt korreleret med tidligere data, der målte ændringer i de relative hastigheder af PEPCK-proteinsyntese hos normale og acidotiske rotter (84). Imidlertid opretholdes det seksfoldige inducerede niveau af PEPCK mRNA hos rotter, der fremstilles kronisk acidotisk, selvom den relative transkriptionshastighed gradvist falder og plateauer på et niveau, der kun er dobbelt større end observeret hos normale rotter (81).
forskellige segmenter af PEPCK-promotoren såvel som kernepromotoren (-460 til +73 bp) indeholdende specifikke blokmutationer i regulatoriske elementer er blevet grundigt analyseret i transgene dyr for at bestemme deres rolle i styring af pck1-genekspression (72). Vildtype – kernepromotoren smeltet sammen med bovint væksthormon (BGH) genet indeholder alle de oplysninger, der er nødvendige for at sikre passende ekspression og hormonel regulering i leveren. Et større 2,3 kb segment af PEPCK-promotoren var påkrævet for at drive ekspression af transgenen i fedtvæv. Imidlertid blev begge disse konstruktioner udtrykt ved lave niveauer i nyrerne. I modsætning hertil blev et CRC362-transgen, der kun indeholder 362 bp af promotoren, men alle nedstrøms eksoner og introner fra rotte PCK1-genet udtrykt ved normale niveauer i nyrerne (40). Dette transgen adskiller sig kun fra det endogene gen ved substitution af et segment af kylling PCK1-genet i den del af den endelige ekson, der koder for 3′ – UTR af PEPCK-mRNA ‘ et. Desuden udviser sidstnævnte konstruktion en signifikant nyrespecifik induktion, når de transgene mus blev fremstillet acidotiske (20).
LLC-PK1-F + celler udviser en pH-responsiv induktion af PEPCK mRNA (64). Tidligere forsøg på at identificere et pH-responsivt element ved forbigående ekspression af forskellige PEPCK-chloramphenicol acetyltransferase reporter konstruktioner i LLC-PK1-F+ celler producerede modstridende resultater (21, 77). Imidlertid fastslog disse undersøgelser klart, at binding af HNF-1 til P2-elementet er afgørende for basal ekspression af renal PEPCK, og at dette protein:DNA-interaktion kan bidrage til øget ekspression under acidose. Luciferasekonstruktioner indeholdende enten 490 eller 2300 bp af PEPCK-promotoren aktiveres stærkt ved cotransfektion af LLC-PK1-F+ celler med den katalytiske underenhed af proteinkinase a (112). Ingen af konstruktionerne udviser imidlertid en forøget aktivitet, når de transficerede celler blev overført til surt medium (pH 6,9, 10 mM HCO−3) (væg et al., upublicerede data, 1999). Denne observation og konstateringen af, at et transgen, der kun indeholder 362 bp af promotoren sammen med nedstrøms eksoner og introner, er tilstrækkeligt til at rekapitulere den pH-responsive induktion (20) antyder, at PEPCK-genet kan indeholde et nedstrøms element, der er essentielt for den pH-responsive stigning i transkription. Andre eksperimenter har fastslået, at C / EBP-Kurt (112) og ATF-2 (44) binder til CRE-1-elementet i PEPCK-genet i nyre.
tidligere undersøgelser har også vist, at halveringstiden for PEPCK mRNA øges i leveren som respons på cAMP (76) og glukokortikoider (132). Øget stabilitet kan også bidrage til vedvarende induktion af renal PEPCK mRNA under kronisk acidose (81). Derfor kan selektiv mRNA-stabilisering også spille en vigtig rolle i den fysiologiske regulering af PEPCK-genekspression. Det tetracyclin-responsive promotorsystem blev brugt til at kvantificere halveringstiden for forskellige kimære mRNA ‘ er i LLC-PK1-f+ celler (67).
mRNA’et, der indeholder hele 3′ -UTR af PEPCK-mRNA ‘ et, blev nedbrudt med en halveringstid på 1,2 timer. RNase h-behandling indikerede, at der opstod hurtig dødenylering samtidig med nedbrydning af mRNA ‘ et for MRG-PCK-1. Tidligere undersøgelser (108) viste, at PCK-7, et 50-nt segment i 3′-enden af 3’-UTR, binder et uidentificeret protein, der kan bidrage til det hurtige henfald af PEPCK mRNA. Imidlertid har den kimære larg-PCK-7 mRNA en halveringstid på 17 timer. Inkludering af det tilstødende PCK-6-segment, en 23-bp AU-rig region, producerede mRNA ‘ et larg-PCK-6/7, der har en halveringstid på 3,6 timer. Det mRNA, der indeholder 3′-halvdelen af 3′-UTR, blev nedbrudt med den samme halveringstid. Overraskende nok blev mRNA’et, der indeholder 5’-enden af 3 ‘ -UTR, også nedbrudt hurtigt (t1/2 = 5,4 timer). RNA gel-shift analyser viste, at AUF1 binder til PCK-7, PCK-6 og PCK-2 segmenter med høj affinitet og specificitet. Mutationsanalyse indikerer, at AUF1 binder til en uuau-UUUAU-sekvens inden for PCK-6 og en stamme-loop-struktur og tilstødende CU-region af PCK-7. AUF1 binder således til flere destabiliserende elementer inden for 3’ -UTR, der deltager i den hurtige omsætning af PEPCK mRNA. Nyere eksperimenter tyder på, at PCK-7-segmentet også binder priskrystallin/NADPH: kinonreduktase med høj affinitet og specificitet (Hajarnis og Curthoys, upublicerede data, 2006). Således kan den samme mekanisme, der tegner sig for den mere gradvise induktion af GA-og GDH-mRNA ‘ erne, også bidrage til den vedvarende stigning i PEPCK-mRNA-niveauer under kronisk acidose.