Die hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) ist eine der am weitesten verbreiteten Methoden zur Trennung und Reinigung von Proteinen in ihrem nativen Zustand. HIC erweist sich auch als sehr nützlich bei der Isolierung von Proteinkomplexen und bei der Untersuchung der Proteinfaltung und -entfaltung. Wie funktioniert HIC? Was sind die Prinzipien hinter dieser Technik? Um den Mechanismus hinter dieser Art der Chromatographie zu verstehen, sind hier einige Dinge, die Sie unbedingt wissen müssen.
Wie funktioniert HIC?
Kurz gesagt, HIC (auch bekannt als ‚Aussalzen‘) trennt Proteinmoleküle unter Verwendung der Eigenschaften der Hydrophobie. Bei diesem Verfahren werden Proteine, die sowohl hydrophile als auch hydrophobe Regionen enthalten, unter Hochsalzpufferbedingungen auf eine HIC-Säule aufgebracht.
Das Salz im Puffer (üblicherweise Ammoniumsulfat) reduziert die Solvation von gelösten Probenstoffen und legt die hydrophoben Bereiche entlang der Oberfläche des Proteinmoleküls frei. Dies erleichtert die Adsorption dieser hydrophoben Bereiche an die hydrophoben Bereiche auf dem festen Träger und fällt Proteine aus der Lösung aus (kristallisiert).
Beachten Sie, dass bei dieser Art der Chromatographie die Zugabe von lyotrophen Salzen die hydrophobe Wirkung verstärkt und die Anzahl und das Volumen der einzelnen hydrophoben Hohlräume verringert, während eine Verringerung der Salzkonzentration zu einer Desorption vom festen Träger führt. Als solches kann die Probenelution durch abnehmenden Salzgradienten erleichtert werden. Dem Elutionspuffer können auch milde organische Modifikatoren oder Detergenzien zugesetzt werden, um den Elutionsprozess zu unterstützen.
Nach den Prinzipien von HIC können Sie Proteine aus wässrigen Lösungen in unterschiedlichem Maße binden, abhängig von der Struktur Ihres interessierenden Proteins, der Salzkonzentration, dem pH-Wert, der Temperatur und den verwendeten organischen Lösungsmitteln.
Hydrophobe Interaktionschromatographie: Aufdeckung der zugrunde liegenden Theorien
Es gibt drei Haupttheorien, die helfen können, den Mechanismus hinter HIC zu erklären – (1) die Aussalzungstheorie, (2) die thermodynamische Theorie und (3) die Oberflächenspannungs- oder Van-der-Waals-Kräfte-Theorie.
Aussalzentheorie
Nach der Aussalzentheorie bilden die hydrophoben Aminosäuren beim Falten in wässriger Lösung geschützte hydrophobe Bereiche, während die hydrophilen Aminosäuren die Bindung von Proteinen mit den Wasserstoffmolekülen im Wasser ermöglichen. Infolgedessen erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, dass sich das Protein in Wasser auflöst, wenn genügend hydrophile Bereiche in der Oberfläche der Proteinmoleküle vorhanden sind.
Bei der Zugabe von antichaotrophen Salzen (wie Ammoniumsulfat und Natriumsulfat) in die Lösung interagieren jedoch einige der Wassermoleküle mit den Salzionen anstelle des geladenen Teils des Proteins. Wenn die Protein-Protein-Wechselwirkungen in der Lösung stärker werden als die Lösungsmittel-gelösten Wechselwirkungen, reagieren die Proteinmoleküle frei miteinander – so dass sie aggregieren und schließlich aus der Lösung ausfallen können. Daher verringert die Zugabe von Salz in der Lösung die Löslichkeit verschiedener Proteine in unterschiedlichem Maße.
Thermodynamische Theorie
Diese Theorie besagt, dass die Wechselwirkung zwischen hydrophoben Molekülen ein entropiegetriebener Prozess ist, der auf dem zweiten Hauptsatz der Thermodynamik basiert. Die hydrophobe Wechselwirkung zwischen zwei oder mehr unpolaren Molekülen in einer polaren Lösungsmittellösung ist ein spontaner Prozess, der durch eine Änderung der Entropie bestimmt wird. Solche Wechselwirkungen können jedoch durch Steuerung der Temperatur oder durch Änderung der Lösungsmittelpolarität verändert werden.
Wenn also ein unpolares Molekül mit einem polaren Lösungsmittel wie Wasser in Kontakt kommt, erhöht sich der Ordnungsgrad der Lösungsmittelmoleküle, die das hydrophobe Molekül umgeben. Solange die Enthalpie nicht signifikant ansteigt, führt dies zu einer Abnahme der Entropie und zu einer insgesamt positiven Änderung der Gibbs-Energie. Als solches wird die Auflösung eines unpolaren Moleküls in einem polaren Lösungsmittel nicht spontan auftreten, da es thermodynamisch nicht günstig ist.
Wenn Sie jedoch zwei oder mehr unpolare Moleküle in eine polare Umgebung bringen, werden die hydrophoben Oberflächen der Makromoleküle vor der polaren Umgebung verborgen und die hydrophoben Moleküle aggregieren spontan. Die stark strukturierten Lösungsmittelmoleküle, die die freiliegende Oberfläche der hydrophoben Moleküle umgeben, werden in Richtung der Masse des Lösungsmittels verschoben, die aus weniger strukturierten Molekülen besteht. Infolgedessen nimmt die Entropie zu, während die Gibbs-Energie abnimmt. In solchen Fällen wird die hydrophobe Wechselwirkung zu einem thermodynamisch günstigen Prozess.
Oberflächenspannung, Van-der-Waals-Theorie
Diese Theorie legt nahe, dass die hydrophobe Wechselwirkung in HIC von van-der-Waals-Kräften zwischen Proteinen und immobilisierten Liganden abhängt, da diese Kräfte zunehmen, wenn die geordnete Struktur von Wasser in Gegenwart von Salzen zunimmt.