Verbesserte Expression von PEPCK-mRNA
Die cytosolische Isoform von PEPCK ist ein primärer Regulationsort sowohl der hepatischen als auch der renalen Glukoneogenese (71). Diese Aktivität wird jedoch nicht durch allosterische Mechanismen oder durch kovalente Modifikationen reguliert. Stattdessen wird es ausschließlich durch Mechanismen reguliert, die das Niveau der PEPCK-mRNA bestimmen und dadurch das Niveau des PEPCK-Proteins steuern. Dies wird durch Änderungen entweder der Syntheserate oder der Abbaurate der PEPCK-mRNA erreicht. Das PCK1-Gen, das für das cytosolische PEPCK kodiert, besteht aus 10 Exons und 9 Introns und ist ungefähr 6 kb lang (13). Es kodiert eine einzelne 2,6-kb-mRNA, die in ein Protein übersetzt wird, das 621 Aminosäuren enthält und eine Masse von 69.300 Da hat. Der PEPCK-mRNA-Spiegel in der Rattenniere ist nach akutem Auftreten einer Azidose rasch erhöht (80). Der Anstieg wird innerhalb von 1 Stunde eingeleitet und erreicht innerhalb von 7 Stunden ein Maximum, das sechsfach höher als normal ist. Transkriptionsablaufexperimente (80) zeigten, dass Änderungen der relativen Transkriptionsrate des PCK1-Gens für die anfängliche Induktion von PEPCK-mRNA verantwortlich sind. Darüber hinaus korrelierten die beobachteten Veränderungen der PEPCK-mRNA-Spiegel eng mit früheren Daten, die Veränderungen der relativen Raten der PEPCK-Proteinsynthese bei normalen und azidotischen Ratten maßen (84). Der sechsfach induzierte Gehalt an PEPCK-mRNA bleibt jedoch bei Ratten erhalten, die chronisch azidotisch gemacht werden, obwohl die relative Transkriptionsrate allmählich abnimmt und auf einem Niveau liegt, das nur doppelt so hoch ist wie bei normalen Ratten (81).
Verschiedene Segmente des PEPCK-Promotors sowie des Kernpromotors (-460 bis +73 bp), die spezifische Blockmutationen in regulatorischen Elementen enthalten, wurden in transgenen Tieren umfassend analysiert, um ihre Rolle bei der Kontrolle der PCK1-Genexpression zu bestimmen (72). Der Wildtyp-Kernpromotor fusioniert mit dem bovinen Wachstumshormon (bGH) -Gen enthält alle Informationen, die notwendig sind, um eine angemessene Expression und hormonelle Regulation in der Leber zu gewährleisten. Ein größeres 2,3-kb-Segment des PEPCK-Promotors war erforderlich, um die Expression des Transgens im Fettgewebe voranzutreiben. Beide Konstrukte wurden jedoch in niedrigen Konzentrationen in der Niere exprimiert. Im Gegensatz dazu wurde ein CRC362-Transgen, das nur 362 bp des Promotors, aber alle nachgeschalteten Exons und Introns des Ratten-PCK1-Gens enthält, in normalen Konzentrationen in der Niere exprimiert (40). Dieses Transgen unterschied sich vom endogenen Gen nur durch die Substitution eines Segments des Hühner-PCK1-Gens in den Teil des endgültigen Exons, der für die 3′-UTR der PEPCK-mRNA kodiert. Darüber hinaus zeigt das letztere Konstrukt eine signifikante nierenspezifische Induktion, wenn die transgenen Mäuse azidotisch gemacht wurden (20).
LLC-PK1-F+ Zellen zeigen eine pH-responsive Induktion von PEPCK mRNA (64). Frühere Versuche, ein pH-responsives Element durch transiente Expression verschiedener PEPCK-Chloramphenicol-Acetyltransferase-Reporterkonstrukte in LLC-PK1-F + -Zellen zu identifizieren, führten zu widersprüchlichen Ergebnissen (21, 77). Diese Studien ergaben jedoch eindeutig, dass die Bindung von HNF-1 an das P2-Element für die basale Expression des renalen Pepcks essentiell ist und dass diese Protein-DNA-Interaktion zu einer erhöhten Expression während der Azidose beitragen kann. Luciferase-Konstrukte, die entweder 490 oder 2300 bp des PEPCK-Promotors enthalten, werden durch Kotransfektion von LLC-PK1-F + -Zellen mit der katalytischen Untereinheit der Proteinkinase A (112) stark aktiviert. Keines der beiden Konstrukte zeigt jedoch eine erhöhte Aktivität, wenn die transfizierten Zellen in saures Medium (pH 6,9, 10 mM HCO−3) transferiert wurden (Wall Q et al., unveröffentlichte Daten, 1999). Diese Beobachtung und der Befund, dass ein Transgen, das nur 362 bp des Promotors zusammen mit den nachgeschalteten Exons und Introns enthält, ausreicht, um die pH-responsive Induktion zu rekapitulieren (20), legen nahe, dass das PEPCK-Gen ein nachgeschaltetes Element enthalten kann, das für die pH-responsive Erhöhung der Transkription essentiell ist. Andere Experimente haben festgestellt, dass C / EBPß (112) und ATF-2 (44) an das CRE-1-Element des PEPCK-Gens in der Niere binden.
Frühere Studien haben auch gezeigt, dass die Halbwertszeit der PEPCK-mRNA in der Leber als Reaktion auf cAMP erhöht ist (76) und Glukokortikoide (132). Eine erhöhte Stabilität kann auch zur anhaltenden Induktion von renaler PEPCK-mRNA während chronischer Azidose beitragen (81). Daher kann die selektive mRNA-Stabilisierung auch eine wichtige Rolle bei der physiologischen Regulation der PEPCK-Genexpression spielen. Das Tetracyclin-responsive Promotorsystem wurde verwendet, um die Halbwertszeit verschiedener chimärer β-Globin-PEPCK (ßG-PCK) mRNAs in LLC-PK1-F + Zellen zu quantifizieren (67).
Die ßG-PCK-1 mRNA, die die gesamte 3′-UTR der PEPCK mRNA enthält, wurde mit einer Halbwertszeit von 1,2 Stunden abgebaut. Die Behandlung mit RNase H zeigte, dass eine schnelle Deadenylierung gleichzeitig mit dem Abbau der ßG-PCK-1-mRNA auftrat. Frühere Studien (108) zeigten, dass PCK-7, ein 50-nt-Segment am 3′-Ende der 3′-UTR, ein nicht identifiziertes Protein bindet, das zum schnellen Zerfall der PEPCK-mRNA beitragen kann. Die chimäre ßG-PCK-7 mRNA hat jedoch eine Halbwertszeit von 17 Stunden. Die Einbeziehung des benachbarten PCK-6-Segments, einer 23-bp-AU-reichen Region, erzeugte die ßG-PCK-6/7-mRNA mit einer Halbwertszeit von 3,6 Stunden. Die ßG-PCK-3 mRNA, die die 3′-Hälfte von 3′-UTR enthält, wurde mit der gleichen Halbwertszeit abgebaut. Überraschenderweise wurde auch die ßG-PCK-2 mRNA, die das 5′-Ende der 3′-UTR enthält, rasch abgebaut (t1/2 = 5,4 Stunden). RNA-Gel-Shift-Analysen ergaben, dass AUF1 mit hoher Affinität und Spezifität an die Segmente PCK-7, PCK-6 und PCK-2 bindet. Die Mutationsanalyse zeigt, dass AUF1 an eine UUAU-UUUAU-Sequenz innerhalb von PCK-6 und eine Stammschleifenstruktur und eine angrenzende CU-Region von PCK-7 bindet. Somit bindet AUF1 an mehrere destabilisierende Elemente innerhalb der 3′ -UTR, die am schnellen Umsatz der PEPCK-mRNA beteiligt sind. Neuere Experimente zeigen, dass das PCK-7-Segment auch binds-Crystallin / NADPH: Chinonreduktase mit hoher Affinität und Spezifität bindet (Hajarnis und Curthoys, unveröffentlichte Daten, 2006). Somit kann derselbe Mechanismus, der für die allmählichere Induktion der GA- und GDH-mRNAs verantwortlich ist, auch zum anhaltenden Anstieg der PEPCK-mRNA-Spiegel während der chronischen Azidose beitragen.