El Papel de las Modificaciones Proteicas de T-Bet en la Producción y Diferenciación de Citocinas de Células T Auxiliares

Resumen

T-Bet (proteína de caja T expresada en células T, también llamada TBX21) se clonó originalmente como un factor de transcripción clave involucrado en el compromiso de las células T auxiliares (Th) con el linaje Th1. T-Bet activa directamente la transcripción del gen IFN y mejora el desarrollo de las células Th1. T-Bet modula simultáneamente las citocinas IL-2 y Th2 de una manera independiente de IFN–, lo que resulta en una atenuación del desarrollo de células Th2. Numerosos estudios han demostrado que T-bet desempeña múltiples funciones en muchos subtipos de células inmunitarias, incluidas las células B, las células dendríticas, las células asesinas naturales (NK), las células T NK y las células linfoides innatas. Por lo tanto, T-bet es crucial para el desarrollo y la coordinación de las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas. Para cumplir estas múltiples funciones, T-bet sufre varias modificaciones de proteínas postraduccionales, como la fosforilación en residuos de tirosina, serina y treonina, y la ubiquitinación en residuos de lisina, que afectan el compromiso de linaje durante la diferenciación de células Th. Esta revisión presenta una visión general actual del progreso realizado en la comprensión de las funciones de varios tipos de modificaciones de la proteína T-bet en la regulación de la producción de citoquinas durante la diferenciación de células Th.

1. Introducción

T – Bet (proteína T-box expresada en células T, también llamada TBX21) se describió por primera vez en 2000 en un informe que examinaba los efectos de T-bet en la diferenciación de las células T helper 1 (Th1). Durante los últimos 15 años, muchos estudios han examinado las funciones de T-bet y han revelado múltiples roles para esta proteína durante la diferenciación de células Th, con un enfoque en los mecanismos moleculares involucrados, las nuevas funciones de este factor de transcripción en las células inmunitarias innatas y la modulación mediada por T-bet de enfermedades inflamatorias . Se ha aclarado que T-bet juega un papel crítico en la coordinación de la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa y que cumple una función importante en la modulación de las enfermedades inflamatorias crónicas, incluyendo el asma y la enfermedad inflamatoria intestinal, al controlar una red de programas genéticos altamente conservados . Por lo tanto, la regulación óptima de la expresión y la actividad de T-bet parece ser beneficiosa para prevenir o tratar la inflamación crónica y las enfermedades autoinmunes.

Aunque se ha intentado identificar las pequeñas moléculas que controlan la expresión y la actividad de T-bet que afectan la respuesta inmune mediada por células T, hasta la fecha se ha avanzado poco en esto. Dada la importancia de T-bet en la regulación inmunitaria, dilucidar los mecanismos funcionales subyacentes a las múltiples funciones de T-bet facilitaría el desarrollo de nuevas intervenciones terapéuticas para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunes crónicas. Esta revisión resume el estado actual del conocimiento sobre los mecanismos moleculares subyacentes a los múltiples roles desempeñados por T-bet en el desarrollo de células Th.

2. Estructura de T-Bet

El T-bet contiene un amino-terminal, un dominio T-box y un carboxilo-terminal, que muestran un 82%, 100% y 79% de homología, respectivamente, entre ratones (530 residuos de proteínas de aminoácidos) y humanos (535 residuos de proteínas de aminoácidos) (Figura 1). El dominio T-box, ubicado entre los residuos 135 y 326 en T-bet de ratón, está altamente conservado en 18 miembros de la familia de proteínas T-box (TBX). Las características comunes que comparten las proteínas de la caja T incluyen la capacidad de unirse al ADN a través del dominio de la caja T y la actividad reguladora de la transcripción, que desempeña un papel en el control de la expresión del gen del desarrollo en todas las especies animales.

Figura 1

la Estructura y la modificación de la proteína de T-bet. T-bet de ratón y humano es 100% idéntico en el dominio T-box. Varios residuos de aminoácidos se conservan en ratones y se someten a modificaciones postraduccionales, incluyendo fosforilación en residuos de serina, treonina y/o tirosina, y ubiquitinación en residuos de lisina.

El dominio T-box se compone de aproximadamente 180 residuos de aminoácidos y es suficiente y necesario para unirse a la secuencia de ADN consensuada TCACACCT . El braquiurio (T) fue la primera proteína T-box en ser identificada y, en forma dimérica, interactúa con los surcos mayores y menores del ADN a través de interacciones hidrofóbicas y contacto inusual del carbonilo de la cadena principal con una guanina como dímero . TBX1 también se une a la secuencia de ADN como un dímero, mientras que TBX2 parece unirse a la misma secuencia de ADN como un monómero . Aunque TBX1 y TBX2 comparten un 61% de identidad en el dominio T-box, la estructura del complejo de unión ADN-T-box parece ser diferente, debido a la baja homología entre las regiones terminales amino y carboxilo. El dominio T-box en T-bet muestra una homología del 50% con el dominio correspondiente en braquiurio (T), TBX1 y TBX2; sin embargo, la estructura cristalina de T-bet unida a la secuencia de ADN aún no se ha caracterizado.

3. Regulación de la Diferenciación de células Th mediante T-Bet

3.1. La estimulación de la diferenciación celular Th1 por T-Bet

T-bet se une directamente a la secuencia de ADN consensuada dentro del promotor IFNG y activa su transcripción. La expresión inducida por T-bet de IFNG deriva células precursoras Th para diferenciarse en células efectoras Th1. Mientras que la sobreexpresión exógena de T-bet en células Th naïve aumenta preferentemente el desarrollo de células Th1, la deficiencia de T-bet conduce a una falla en la producción de IFN-γ suficiente y, por lo tanto, reduce la generación de células Th1 . La expresión de T-Bet se incrementa sustancialmente mediante la estimulación del receptor de células T (TCR) y se incrementa mediante el cotratamiento con IFN-γ e IL-12. El IFN-γ se une a su receptor e induce la activación del transductor de señal y activador de transcripción (STAT) 1 y la transcripción del gen T-bet (TBX21). Posteriormente, T-bet estimula directamente la transcripción de IFNG, así como de IL12RB2. La expresión del receptor de IL-12 (IL-12R) β2 en la superficie celular mejora aún más la producción de IFN-γ a través de la IL-12 y la vía de señalización STAT4, lo que resulta en una diferenciación celular Th1 preferencial. Curiosamente, la expresión forzada de T-bet también puede convertir las células Th2 diferenciadas en células Th1 . Por lo tanto, T-bet se coloca en el meollo de las vías reguladoras que inducen IFN-γ en las células Th.

3.2. Atenuación de la producción de IL-2 mediante T-Bet

Además de la regulación IFN-γ, T-bet suprime significativamente la expresión. Esta citocina, un factor de crecimiento temprano de las células T, es esencial para la activación, proliferación y diferenciación de las células Th y se produce en abundancia tras la estimulación de la TCR. T-bet introducido ectópicamente suprime significativamente la producción de IL-2 a través de la inhibición de la actividad de p65 del factor nuclear kB (NF-kB), en condiciones de diferenciación Th1 y Th2 . Durante la diferenciación de células Th1, la transcripción de IL-2 también se atenúa tras la inducción de T-bet. La inhibición de la IL-2 mediada por T-bet puede afectar a la expansión de las células Th y modular exquisitamente la respuesta inmunitaria mediada por Th1 tras la exposición a un antígeno patógeno.

3.3. Supresión del Desarrollo de células Th2 por T-Bet

Además, la introducción exógena de T-bet en las células Th suprime la producción de citocinas Th2, como IL-4, IL-5 e IL-13, a través de la supresión de la proteína 3 de unión a GATA (GATA-3). En consecuencia, la falta de T-bet induce el desarrollo espontáneo de células Th2 in vitro e in vivo . La actividad supresora de Th2 de T-bet también se confirmó en ausencia de IFN-γ, lo que indica que T-bet tiene una función inhibitoria discreta, independiente de la estimulación de IFN-γ.

3.4. Otras funciones de T-Bet

Recientemente, muchos estudios han informado que T-bet también modula otros linajes de células Th, incluidas las células Th17, Treg y TH folicular (TFH), en coordinación con muchos factores de transcripción, como el receptor huérfano relacionado con el ácido retinoico-yt (RORyt), el factor de transcripción 3 relacionado con runt (RUNX3) y el linfoma de células B-6 (BCL6) . Estos hallazgos sugieren que T-bet es un factor de transcripción que es crítico para el desarrollo de células Th de ajuste fino.

4. Modificación postraduccional de T-Bet

T-Bet funciona como un jugador multitarea en la regulación de la diferenciación de células Th. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a la actividad estimulante e inhibitoria de T-bet en la regulación de la expresión génica diana aún no se han aclarado. Se sabe que muchas proteínas multitarea experimentan modificaciones de proteínas postraduccionales y determinan el destino de las células ejerciendo una actividad inhibitoria directa y estimulante indirecta en la expresión génica diana .

4.1. La fosforilación de tirosina de T-Bet

La detección basada en anticuerpos de proteínas T-bet en western blots da como resultado múltiples bandas, lo que sugiere la modificación postraduccional de T-bet en células Th activadas por TCR. La fosforilación de tirosina de la proteína T-bet ocurre principalmente durante las primeras etapas (días 2 a 3) del desarrollo de las células Th, en el compromiso de la TCR, y disminuye después. El tratamiento de las células Th con el inhibidor de la tirosina fosfatasa pervanadato mejora la fosforilación de la tirosina de T-bet. T-Bet se localiza principalmente en el núcleo, y la tirosina cinasa nuclear inducible por IL2 (ITK) fue identificada como la tirosina quinasa responsable aguas arriba. La deficiencia de ITK previene la fosforilación de tirosina de T-bet en células Th después de la estimulación con TCR e IL-12. La investigación mutacional ha revelado que el residuo de tirosina 525 (Y525) es el sitio de fosforilación relevante y que la fosforilación en este sitio juega un papel importante en la interacción con GATA-3. Aunque el dominio T-box en T-bet es importante para la interacción ADN y proteína-proteína, la fosforilación de tirosina de Y525 es un requisito previo para la supresión de la diferenciación celular Th2 mediada por GATA-3. El bloqueo de la fosforilación Y525 abroga la interacción y la supresión de GATA-3, lo que resulta en un deterioro de la supresión de Th2 .

Además, otra tirosina cinasa nuclear, c-Abl, induce la fosforilación de T-bet en residuos de tirosina 219, 265 y 304 en T-bet de ratón . Una deficiencia en c-Abl, así como la mutación de T-bet en estos residuos (mutantes Y219/265/304F) conduce a un fracaso para aumentar la inducción de IFN-γ y suprimir la producción de citoquinas Th2, debido a la pérdida de fosforilación en estos residuos de tirosina. Esto, a su vez, resulta en el agravamiento de la inflamación alérgica pulmonar in vivo . Estos hallazgos sugieren que la fosforilación de tirosina inducida por ITK y c-Abl de T-bet es esencial para la modulación del desarrollo de células Th2 y la respuesta inmune alérgica.

4.2. Fosforilación de serina de T-Bet

Aunque la supresión mediada por T-bet del desarrollo de células Th2 se ve afectada por la mutación de Y525 y la ausencia de cinasa c-Abl, la supresión de IL-2 se mantiene con una T-bet mutante de Y525, lo que sugiere la existencia de un mecanismo regulador adicional para la modulación de IL-2 . Curiosamente, la aparición de múltiples bandas de proteína T-bet en western blots podría eliminarse mediante la adición de fosfatasa intestinal del ternero, que elimina predominantemente la fosforilación en residuos de serina/treonina. El análisis espectrométrico de masas reveló la serina 508 (S508) como otro sitio de fosforilación en T-bet. La mutación de S508 elimina la fosforilación mediada por caseína quinasa (CK) y glucógeno sintasa quinasa – 3 (GSK-3) en T-bet, así como la actividad supresora de IL-2 de la proteína. Además, la fosforilación S508 es importante para la interacción de T-bet con NF-kB p65 y para la prevención de la unión de NF-kB p65 al promotor IL2. De acuerdo con la función de T-bet como inhibidor de NF-kB p65, las células Th1 nulas de T-bet mantienen la actividad de NF-kB p65 durante la diferenciación de células Th1 y, por lo tanto, producen más IL-2. Por lo tanto, se ha sugerido que T-bet es un inhibidor fisiológico de la IL-2 durante la diferenciación celular Th1, a través de la supresión dependiente de la fosforilación S508 de NF-kB p65.

4.3. Fosforilación de treonina de T-Bet

Muy recientemente, la treonina 302 (T302) se caracterizó como un nuevo sitio de fosforilación en T-bet , aunque no está claro qué quinasa y fosfatasa afectan la fosforilación de este residuo. Sin embargo, la restauración de células Th nulas de T-bet con un T-bet mutante de T302 estimuló la producción de IFN-γ tanto como lo hizo el T-bet de tipo salvaje; sin embargo, el mutante no pudo suprimir la IL-2 y otras citocinas Th2. Análisis posteriores demostraron que la fosforilación T302 es necesaria para la interacción de T-bet con el factor nuclear de células T activadas (NFAT) y para la regulación a la baja de citocinas IL-2 y Th2 mediadas por NFAT, como IL-4, IL-5 e IL-13. NFAT no es crucial para la inducción de la producción de IFN-γ y T-bet mutante de T302 es capaz de unirse al promotor de IFNG; por lo tanto, la producción de IFN-γ fue comparable entre T-bet mutante y de tipo salvaje. En otras palabras, la mutación de T302 anuló la supresión mediada por T-bet de la producción de citoquinas IL-2 y Th2, pero no afectó la unión al ADN ni la actividad estimuladora de IFN-γ de T-bet.

De hecho, T302 se encuentra en la caja T de unión al ADN, al igual que Y304 . El dominio T-box consiste en varias repeticiones de hebras β y hélices α y está involucrado tanto en la dimerización como en la unión al ADN . Muller y Herrmann predijeron que las hélices α aH3 y aH4 en el braquiurio (T) son importantes para la interacción directa de esta proteína con los surcos menores y mayores del ADN . Sin embargo, T302 puede no estar asociado directamente con los surcos del ADN, independientemente de su estado de fosforilación. Sería interesante saber qué quinasa y fosfatasa aguas arriba regulan la fosforilación de T302 y si la fosforilación de T302 afecta a otras modificaciones de proteínas de T-bet.

4.4. La ubiquitinación de Lisina 313 en T-Bet

La expresión de T-bet es crítica para la regulación transcripcional de IFNG y para el desarrollo de células Th1, pero los medios de regulación de T-bet a nivel de proteína aún no se han identificado. Jang et al. han informado recientemente que T-bet sufre degradación proteasómica mediada por ubiquitinación durante las últimas etapas de la diferenciación celular Th1 . De los 16 residuos de lisina presentes en la proteína T-bet de ratón, 11 se encuentran predominantemente dentro del dominio T-box, y los 5 restantes se encuentran en el carboxilo-terminal (residuos del 326 al 530), mientras que no hay residuos de lisina presentes en el amino-terminal (residuos del 1 al 134). Curiosamente, los residuos de lisina dentro del dominio de la caja T se ubican preferentemente tras la sobreexpresión de la ubiquitina. Análisis adicionales han identificado que la mutación de lisina 313 (K313) disminuye la degradación de T-bet mediada por ubiquitinación y mejora el nivel de expresión de T-bet en el núcleo y el citoplasma. A pesar del aumento de los niveles del mutante K313, esta mutación abrogó completamente las funciones de T-bet que implican la unión al ADN, la activación transcripcional de IFNG y la supresión de la producción de citocinas IL-2 y Th2. La estructura cristalina de las hélices α del dominio T-box unido al ADN sugiere fuertemente que el grupo amino de K313 está asociado con el fosfato de una base de ADN a través de la interacción de enlace de hidrógeno. Además, la mutación de K313 también conduce a la incapacidad de suprimir la producción de citoquinas IL-2 y Th2; sin embargo, la interacción y la supresión de GATA-3 y NF-kB p65 no se ven alteradas por la mutación de K313. Curiosamente, la interacción NFAT es abolida en T-bet mutante de K313, que también está fuertemente asociada con la ausencia de fosforilación en T302. Todavía no está claro si y cómo regula K313 la fosforilación de T302 y viceversa.

5. T-Bet en Enfermedades Inflamatorias y Autoinmunes

Desde Mosmann et al. subconjuntos Th1 y Th2 descubiertos que producen citocinas distintivas, IFN-γ e IL-4, IL-5 e IL-13, respectivamente, y que modulan las respuestas inmunitarias inflamatorias y alérgicas , otros estudios han identificado subconjuntos nuevos de células Th, como las células Th17, TFH y Treg . Estudios extensos también han caracterizado las vías de señalización de citoquinas y los factores de transcripción involucrados en la regulación de las respuestas inmunitarias a los patógenos . Es importante destacar que T-bet juega un papel fundamental en el control de la diferenciación de varios subconjuntos de células Th y en la modulación de enfermedades inflamatorias y autoinmunes .

T-Bet también funciona como regulador antiasmático. Una deficiencia en T-bet conduce espontáneamente al desarrollo de síntomas asmáticos, que se caracterizan por una mayor infiltración de eosinófilos en las vías respiratorias, hiperplasia de células cálices secretoras de moco y remodelación crónica de las vías respiratorias con acumulación de colágeno y miofibroblastos proliferativos; estas características a menudo también se observan en pacientes asmáticos . La restauración de la expresión de T-bet cambia el equilibrio inmunitario a una respuesta Th1 y previene y atenúa la inflamación pulmonar patológica in vivo .

Además, T-bet está protegido contra infecciones patógenas intracelulares. La abrogación de la producción de IFN-γ inducida por T-bet resultó en una mayor susceptibilidad a patógenos intracelulares in vivo, incluyendo Mycobacterium tuberculosis, Leishmania major y Salmonella typhimurium , enfatizando la importancia de la producción de IFN-γ por las células Th1 que expresan T-bet en la defensa contra infecciones bacterianas. Sin embargo, los ratones deficientes en T-bet son resistentes a la infección por Listeria monocytogenes, porque la producción de INF-γ por células asesinas naturales es necesaria y suficiente para la defensa del huésped contra L. monocytogenes .

Además, T-bet puede agravar el desarrollo de enfermedades inflamatorias y autoinmunes, incluyendo enfermedad inflamatoria intestinal, encefalomielitis autoinmune experimental, artritis inflamatoria y diabetes tipo I, ya que estas enfermedades inflamatorias se atenúan en ausencia de T-bet . Estos hallazgos sugieren que el ajuste fino de la respuesta inmune mediante la modulación de la expresión de T-bet podría tener efectos beneficiosos para pacientes con asma crónica, enfermedad inflamatoria intestinal, artritis, esclerosis múltiple y diabetes.

6. Conclusiones y perspectivas

T-bet es un factor de transcripción que contiene un dominio de T-box que está típicamente involucrado en la regulación del desarrollo, pero ejerce múltiples funciones en la diferenciación de células Th; activación transcripcional de células Th1 que expresan IFN-γ, supresión indirecta del desarrollo de células Th2, Th17 y Treg, y modulación fina de la producción de IL-2 en células Th1. Esta multitarea no es sorprendente, ya que T-bet sufre varias modificaciones posteriores a la traducción. La fosforilación en Y525 juega un papel en la supresión de GATA-3 durante la regulación Th2, la fosforilación en S508 causa la supresión de NF-kB p65 en el contexto de la regulación de IL-2 en las células Th1, la fosforilación en T302 juega un papel en el ajuste fino de la producción de IL-2, y la ubiquitinación en K313 juega un papel en el control de la estabilidad de la proteína T-bet. Así, la modificación postraduccional de T-bet facilita su diversidad funcional y la complejidad de su modulación de la expresión de citoquinas (Figura 2). No se sabe si las diversas modificaciones postraduccionales ocurren secuencialmente o simultáneamente, si un tipo de modificación de proteínas afecta a otra modificación, o si los cambios en la modificación postraduccional de T-bet están relacionados con el desarrollo de enfermedades inflamatorias infecciosas y crónicas. Una mayor identificación de nuevas modificaciones de proteínas relacionadas con las funciones de T-bet proporcionaría información valiosa sobre el desarrollo de poderosas intervenciones terapéuticas para controlar las enfermedades inflamatorias y autoinmunes crónicas.

Figura 2

Varios T-bet funciones a desempeñar un papel en la diferenciación de células Th. La inducción de la expresión de T-bet a través de la activación de STAT1 y STAT4 estimula directamente la transcripción de genes que contienen elementos de unión a T-box, como IFNG, IL12RB2 y CXCR3, mejorando así el desarrollo de células Th1. T-Bet sufre fosforilación de serina en S508 y luego regula a la baja la producción de IL-2 en células Th1 reclutando NF-kB p65 del promotor de IL2. Los niveles de proteína de T-bet en las células Th1 pueden ser controlados por la vía de degradación proteosómica mediada por ubiquitina. Además, la proteína T-bet sufre modificaciones adicionales postraduccionales, por ejemplo, fosforilación en T302 e Y525, lo que facilita su supresión de la producción de citoquinas Th2 inducida por la activación de NFAT y GATA-3.

Lista de Abreviaturas

Conflicto de intereses

No se ha revelado ningún conflicto de intereses potencial.

Reconocimiento

Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigadores de Mitad de Carrera a través de la Subvención NRF (2013R1A2A2A01068302).