- Abstract
- 1. Johdanto
- 2. Materiaalit ja menetelmät
- 2.1. Potilasnäytteet
- 2.2. Verikoe – ja Tautiaktiivisuuden laskeminen
- 2, 3. EBV Immortalization
- 2.4. Virtaussytometria
- 2.5. Lcls – Proliferaatiomääritys
- 2.6. Tilastollinen analyysi
- 3. Tulokset ja keskustelu
- 3. 1. Tutkimushenkilöiden sairausaktiivisuus
- 3.2. LCLs
- 3.3. Syntyneiden LCLs-arvojen kasvunopeus ja Kaksinkertaistumisajan laskeminen
- 3.4. Pintamarkkeriekspressio LCLs
- 3.5. Taudin aktiivisuuden korrelaatio, Pintamarkkeriilmaisutaso ja LCL-proliferaatio
- 4. Päätelmät
- tietojen saatavuus
- eturistiriidat
- kiitokset
- lisämateriaalit
Abstract
Epstein-Barr-virus (EBV) on yksi ihmisen yleisistä herpesvirustyypeistä maailmassa. EBV: n tiedetään tartuttavan yli 95 prosenttia maailman aikuisista. Virus tarttuu pääasiassa B-lymfosyytteihin ja voi ikuistaa ja muuttaa solut EBV-kantaviksi lymfoblastoidisolulinjoiksi (lcls). Rajalliset tutkimukset ovat keskittyneet ikuistettujen LCLs: ien pintamarkkeriilmaisun luonnehtimiseen. Tämä tutkimus osoittaa sukupolven 15 LCLs kuusitoista nivelreuma (RA) potilaat ja terve vapaaehtoinen käyttäen B95-8 marmoset johdettu EBV. LCL-sukupolven onnistumisprosentti oli 88,23. Kaikki CD19 + LCLs ilmaistuna cd23 (16, 94-58, 9%) ja CD27 (15, 74-80, 89%) solun pinnalla. Aineistomme osoitti kaksi erillistä LCLs-luokkaa (nopea-ja hidaskasvuinen) (p<0, 05) niiden kaksinkertaistumisajan perusteella. Hitaasti kasvavien LCLs: ien CD23-taso oli alhaisempi (35,28%) verrattuna nopeasti kasvaviin LCLs: iin (42,39%). Sen sijaan hitaassa kasvussa olevat LCLs-arvot olivat suurempia sekä pelkällä CD27: llä että yhdistelmällä CD23+CD27+. Kaiken kaikkiaan nämä löydökset voivat viitata solujen CD23 ja CD27 ilmentymisen korrelaatioihin syntyneiden LCLs: ien proliferaationopeuden kanssa. Lisätä ilmentymistä CD23 voi olla rooli EBV immortalization B-solujen ja kasvua ja ylläpitoa EBV-muunnettu LCLs kun taas CD27 lauseke voi olla estävä vaikutuksia LCL proliferaatiota. Jatkotutkimukset ovat aiheellisia näiden spekulaatioiden vuoksi.
1. Johdanto
Epstein-Barr-virus (EBV) on tarttunut maailmanlaajuisesti yli 95% aikuisista . EBV kohdistaa ja tartuttaa pääasiassa B-soluja, joita seuraavat epiteelisolut ja vähäisemmässä määrin CD4 T-solut . Infektiivisiä virioneita syntyy Lyytisen replikaation seurauksena B-soluissa ja epiteelisoluissa. Lyytisen syklin jälkeen EBV-latenssi seuraa ja säilyy infektoituneissa B-soluissa yksilön loppuelämän ajan . EBV aiheuttaa pääasiassa tarttuvaa mononukleoosia ja siihen liittyy läheisesti myös sekä imukudos-että epiteelikasvaimia, kuten Burkittin lymfooma, Hodgkinin lymfooma, nenänielun karsinooma ja mahasyöpä .
EBV tarttuu B-soluihin ja voi ikuistaa B-solut ja muodostaa pitkäaikaiskasvuisia LCL: iä, jotka ilmentävät viruksia johdonmukaisesti . Tätä menetelmää on käytetty laboratorioissa ikuistamaan tiettyjä ihmisen verestä johdettuja B-soluja, joita voidaan myöhemmin käyttää viljelmämallina erilaisissa tutkimuksissa, mukaan lukien laajamittainen lääkeainekirjaston seulonta, rokotetutkimus ja suuritehoiset Biologiset tutkimukset . Kaikista, EBV tuotettu B95-8, marmoset solulinja, näyttää olevan yleisin ja voimakas EBV lähde B-solujen ikuistamiseen. Tutkijat ovat viime vuosikymmeninä pyrkineet parantamaan kuolemattomuusmenetelmää ja sen tehokkuutta . Viime aikoina on osoitettu, että pienellä muutoksella LCLs voisi syntyä pienestä määrästä ääreisveren niinkin alhainen kuin 0,1 mL . Tämä havainto on erityisen hyödyllinen olosuhteissa, joissa näytteen tilavuus on rajallinen.
aiemmissa tutkimuksissa on todettu, että immuunisoluilla, erityisesti B-soluilla ja niiden alaryhmillä, on keskeinen rooli nivelreuman patogeneesissä . B-solujen EBV-immortalisoinnin onnistumisesta huolimatta LCLs: n luonnehtimiselle ja sen vertaamiselle vanhempien B-soluihin on tehty vain vähän. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että EBV voisi tehokkaasti ikuistaa B-soluja nivelreumapotilaiden ääreisverestä ja muodostaa LCL: iä. Tämän jälkeen tutkimme useiden B-solujen alapopulaatiomarkkereiden, kuten CD23: n ja CD27: n, lauseketasoja sekä LCLs: ssä että niiden vanhempien B-soluissa. Nämä B-solujen alapopulaatiot on aiemmin yhdistetty nivelreumapotilaiden kliiniseen esitystapaan. Nivelreumapotilailla on esimerkiksi havaittu kohonneita B-soluja, jotka ilmentävät CD23: A, ja monoklonaaliset vasta-aineet voivat estää niitä . Vastaavasti cd27+IgD – muisti B-solujen lisääntyminen havaittiin helposti myös potilailla, joilla oli aktiivinen nivelreuma . Toisaalta Hu ja työtoverit osoittivat, että CD27 + B-solut korreloivat negatiivisesti nivelreuman tautiaktiivisuuden kanssa ja niiden havaittiin heikentyneen potilailla .
tässä tutkimuksessa pyrittiin arvioimaan nivelreumapotilaiden PBMCs-ja LCLs-solujen cd23: n ja/tai CD27: n ilmentymistasoa. Tutkimme myös Cd23: n ja CD27: n ilmentymistasoa LCLs: n solujen kasvun osalta.
2. Materiaalit ja menetelmät
2.1. Potilasnäytteet
5 ml perifeeristä verta kuudeltatoista NIVELREUMAPOTILAALTA (Taulukko 1) kerättiin Sunway Medical Centrestä, Malesiasta, eettisellä hyväksymiskoodilla 011/2017/ER. Pbmc: t eristettiin Ficoll-Paque (GE Healthcare) – menetelmällä. Lyhyesti EDTA-putkeen kerätty veri laimennettiin 1-1 steriilillä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja kerrostettiin Ficoll-Paque-liuokseen tuoreessa sentrifugiputkessa. Putkea sentrifugoitiin 400 xg: n lämpötilassa 40 minuutin ajan huoneenlämmössä pienellä kiihtyvyydellä ja ”jarrut pois päältä”. Ylin kerros, joka on plasma, kerättiin ja lainattiin ennen varastointia -80°C: ssa.Pbmc: tä sisältävä buffy coat kerättiin 3 ml: n Pasteur-pipetillä ja siirrettiin tuoreeseen sentrifugiputkeen. Solut pestiin kahdesti PBS: llä ja sen jälkeen RPMI-mediumilla, joka sisälsi 10% sikiön naudan seerumia (FBS), ennen kuin ne varastoitiin 10% DMSO: ssa ja varastoitiin nestemäisen typen varastosäiliöön. 5 ml verta luovutettiin terveeltä vapaaehtoiselta verrokkina. Pbmc: t ja plasma käsiteltiin ja varastoitiin edellä kuvatulla tavalla. Diagnoosin päivämäärä, verinäytteenotto, pbmcs-kylmäsäilytys ja EBV-immortalisointi on esitetty Lisämateriaaleissa (saatavilla täältä).
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Anti-CCP: anti-syklinen sitrullinoitu peptidivasta-aine; CRP: C-reaktiivinen proteiini; DAS28: disease activity score 28; ESR: punasolujen sedimentaationopeus; RF: reumatekijä.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2.2. Verikoe – ja Tautiaktiivisuuden laskeminen
2, 3. EBV Immortalization
B95-8 marmoset-johdettu EBV-supernatantti oli ystävällinen lahja Tri Alan Soo-Beng Khoolta, Molecular Pathology unit, Institute for Medical Research (IMR), Malesia. Potilaan ääreisveren B-solut ikuistettiin käyttämällä konsentroitua EBV-supernatanttia, kuten aiemmin on kuvattu . Supplementary Materials-julkaisussa olevasta taulukosta käy ilmi pbmc: n eristämisen ja kryosäilytyksen päivämäärä, LCLs: n perustaminen ja nestetypen varastosäiliöön varastoitujen kryosäilöisten Pbmc: iden kesto. Lyhyesti, injektiopullo aiemmin kryopreservoitua PBMC: tä sulatettiin ja solujen määrä määritettiin. Solut säädettiin arvoon 2 x 106/mL käyttäen vastasulatettua EBV-supernatanttia ja inkuboitiin yön yli 37°C: ssa, 5% CO2: ta seisovassa T25-pullossa. Seuraavana päivänä pulloon lisättiin muunnosainetta (RPMI 1640 + 20% FBS + 200ng/ml siklosporiinia). EBV-tartunnan saaneiden solujen havaittiin mikroskoopilla etsivän ruusukkeen kaltaisia muuntuneita LCL: iä ryppäissä. Virtaussytometriassa ja soluproliferaation määrityksessä käytettiin kohtien 3-6 LCLs-arvoja.
2.4. Virtaussytometria
Kolmivärisytometria tehtiin FACSCalibur-virtaussytometrillä (Becton Dickinson) käyttäen monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tunnistivat pinta-antigeenejä T-soluille (CD3/PE, klooni SK7), B-soluille (CD19/BB515, HIB19) ja B-solujen osajoukoille (CD23/APC, klooni EBV-CS5 ja CD27/PE, klooni L128). Solujen elinkykyliuos 7aad (via-PROBE) ostettiin solujen elinkyvyn määrittämiseksi. Kaikki vasta-aineet ostettiin Becton Dickinsonilta. Lyhyesti, kryopreservoidut Pbmc: t sulatettiin ja suspendoitiin uudelleen 50ΜL: aan BSA-tahrapuskuria (Becton Dickinson) ja inkuboitiin huoneenlämmössä pimeässä ennalta fluorochrome-konjugoiduilla vasta-aineilla 30 minuutin ajan. Tämän jälkeen PBMCs pestiin kahdesti BSA-tahrapuskurilla ja suspendoitiin uudelleen 500µl: aan BSA-puskuria virtaussytometrian analyysia varten. Kontrolli-PBMC-suspensiot valmistettiin samalla menettelyllä. 20 000 elinkykyisellä väriaineella määritettyä elävää solua aidattiin ja kerättiin kolmivärianalyysiä varten CD3/CD19/CD23-ja CD19/CD27/CD23-sarjoista. Tiedot analysoitiin cellquest Pro-ohjelmiston (Becton Dickinson) avulla.
2.5. Lcls – Proliferaatiomääritys
LCLs-arvojen erottamiseksi kahteen ryhmään (nopeasti ja hitaasti kasvavat) solujen proliferaationopeus määritettiin RealTime-Glo MT cell livelability assay (Promega) – menetelmällä valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tämä on epälyleettinen luminesenssiin perustuva määritys, jolla voidaan havaita elävien solujen reaaliaikainen proliferaatio viljelmässä jopa 72 tunnin ajan. Lyhyesti, 10000 solua/kaivo kylvettiin valkoiselle tasapohjaiselle 96-kaivolevylle (Greiner Bio-one) kolmena kappaleena. 2x reaktioseos valmistettiin mukana toimitetusta pakkauksesta ja lisättiin jokaiseen kaivoon. Soluja inkuboitiin 37°C: ssa, 5% CO2: ssa 1 tunnin ajan ennen kuin mittaus tehtiin eri ajankohtina (0, 16, 20, 24, 40, 44, 48, 64, 68, ja 72 tuntia) käyttäen luminesenssimikroplaattilukijaa (Tecan). Suhteellinen luminesenssiyksikkö (rlus) vs. aika-kuvaaja piirrettiin LCLs: n kasvukäyrän näyttämiseksi. Tässä kuvaajassa solun lukua edusti RLUs. RLUs: n avulla kunkin LCLs: n luokan tuplausaika (aika, joka tarvitaan solun numeron kaksinkertaistumiseen) laskettiin monipistelaskimella, jota käytettiin merkitsevyystesteissä . Tämä verkkotyökalu käyttää pienimmän neliösumman sopivaa eksponentiaalista menetelmää tuplausajan laskemiseen . Tämän jälkeen kasvunopeus (aikayksikköä kohti tapahtuvien tuplaantumisten määrä) laskettiin seuraavalla kaavalla:kaikkien LCLs: n kaksinkertaistumisajan keskiarvo oli 54, 69 tuntia. Näin ollen tätä arvoa käytettiin cutoff-ja LCLs-arvona, jonka tuplausaika oli suurempi kuin 54.69 tuntia ryhmiteltiin hidaskasvuisiin nestekidenäyttöihin ja päinvastoin nopeakasvuisiin nestekidenäyttöihin.
2.6. Tilastollinen analyysi
Virtaussytometria-analyysi tehtiin kolmessa erillisessä kokeessa kullekin LCLs-luokalle, ellei toisin mainita. Tiedot ilmaistiin keskiarvoina keskihajonnat (std. dev). Merkitsevyys määritettiin nonparametrisilla testeillä (Mann-Whitney ja Kruskal-Wallis H), joissa dataa pidetään merkittävänä, kun p on alle 0,05.
3. Tulokset ja keskustelu
3. 1. Tutkimushenkilöiden sairausaktiivisuus
taulukossa 1 esitetään kuudentoista NIVELREUMAPOTILAAN ja terveen yksilön demografiset tiedot ja heidän verikoetuloksensa yleisesti käytetyistä nivelreuman diagnostisista merkkiaineista, jotka osoittavat heidän sairausaktiivisuutensa. 16 NIVELREUMAPOTILAAN DAS28-CRP-indeksin perusteella näistä potilaista 3 luokiteltiin taudin korkeaksi aktiivisuudeksi, 8 kohtalaiseksi aktiivisuudeksi, 3 remissioksi ja loput kaksi tuntemattomaksi puutteellisen tiedonkeruun vuoksi.
3.2. LCLs
Pbmc: t kerättiin kuudeltatoista NIVELREUMAPOTILAALTA ja yhdeltä terveeltä luovuttajalta (merkitty C: ksi) (Taulukko 1), ja kryovarastoitiin. Tämän jälkeen EBV-infektioon käytettiin aliquoteja kryosäilyttäviä Pbmc-yhdisteitä. Seitsemästätoista pullosta 15 EBV-transformoitua LCLs: ää (lukuun ottamatta 4E: tä ja 14a: ta) syntyi viikon kuluttua tartunnasta, jolloin pulloista näkyi näkyviä soluryppäitä. Kun LCLs: t visualisoitiin mikroskoopilla, ne näyttivät tyypillisen ruusukkeen morfologian, jossa oli erikokoisia punaisia nuolia (Kuva 1). LCLs-sukupolven onnistumisprosentti oli 88,23% (15 / 17).
3.3. Syntyneiden LCLs-arvojen kasvunopeus ja Kaksinkertaistumisajan laskeminen
määritimme sitten kunkin tuotetun LCLs-luokan kasvunopeuden epälyleettisellä ja reaaliaikaisella luminesenssiin perustuvalla solujen proliferaatiomäärityksellä. Kuvassa 2 esitetään kunkin LCLs-luokan kasvukäyrä, jota edustavat suhteelliset luminesenssiyksiköt (rlus). Taulukossa 2 esitetään kunkin LCLs: n laskettu kaksinkertaistumisaika ja kasvunopeus online-laskimella . Vuodesta saatu kaksinkertaistaminen aika kunkin luokan LCLs, jaamme LCLs kahteen luokkaan käyttäen 54.Cut-off-arvona 69 tuntia (kaikkien LCLs: ien keskiarvo), jolloin tuloksena oli 10 nopeasti kasvavaa ja 5 hitaasti kasvavaa LCLs: ää (taulukot 2 ja 4) (p<0, 05).
3.4. Pintamarkkeriekspressio LCLs
Pbmcs: lle ja vastaavalle LCLs: lle tehtiin virtaussytometria-analyysi niiden pintamarkkeriekspression määrittämiseksi, mukaan lukien CD3, CD19, CD23 ja CD27. CD3 ja CD19 ovat T-solujen pintamarkkereita ja B-solujen pintamarkkereita. Esimerkkeinä potilaasta 8A eristetyt Pbmc: t ja vastaavat LCL-8A: t, Kuvassa 3 esitetään, miten CD3+ T-solut ja CD19+ B-solut profiloitiin ja aidattiin virtaussytometrialla. Tämän jälkeen ekspressiotaso esitettiin prosentteina analysoitujen lymfosyyttien kokonaismäärästä, joka oli 20 000 solua. Luovuttajien Pbmc-soluista 29,78-81,8% oli T-soluja ja 2,35-45,95% B-soluja. EBV-transformaation jälkeen T-solupopulaatiot pienenivät 0-0, 27%: iin, kun taas B-solupopulaatiot kasvoivat 68,59-89,35%: iin. Tämä kertoo selvästi T-solukannan vallanneen EBV: n B-solujen kuolemisen onnistumisesta. CD3+ T-solut hävitetään ja ne pestään kokonaan pois LCLs: stä.
CD23 on B-solujen aktivointimerkki, kun taas CD27 on muistin B-solujen markkeri . Nivelreumapotilailla cd23: a ilmentävien B-solujen kohonneiden pitoisuuksien on aiemmin raportoitu korreloivan positiivisesti taudin aktiivisuuden kanssa, ja ne voivat mahdollisesti toimia terapeuttisena kohteena . Sen sijaan CD27+ B-solujen havaittiin korreloivan negatiivisesti taudin aktiivisuuden kanssa ja niiden havaittiin heikentyneen nivelreumapotilailla . Nykyisessä tutkimuksessa emme pystyneet erottamaan Cd23: n ja CD27: n lauseketta PBMCs: ssä ja LCLs: ssä (Taulukko 3). Kuvassa 4 esitetään CD19+: n, CD23+: n ja CD27+: n poraaminen potilaasta 8A eristetyistä Pbmc: stä ja vastaavasta LCL-8A: sta virtaussytometrialla. Kaikista LCLs, kun 68.59-89.35% oli CD19+ odotetusti, ne ilmentävät cd23 (16.94-58.9%) ja CD27 (15.74-80.89%). B-solujen yhteisvaikutus CD23: n ja CD27: n välillä oli 5, 72-41, 53% (Taulukko 3).
3.5. Taudin aktiivisuuden korrelaatio, Pintamarkkeriilmaisutaso ja LCL-proliferaatio
tehtiin tilastollinen analyysi taudin aktiivisuuden ja pintamarkkeriilmaisujen välisen korrelaation testaamiseksi; yhdelläkään niistä ei kuitenkaan ollut merkitystä. Myöskään taudin aktiivisuus ei korreloinut vastaavan LCLs: n kasvunopeuden kanssa.
kunkin LCLs-luokan kaksinkertaistumisajan jälkeen sekä nopeasti että hitaasti kasvavien LCLs – arvojen keskiarvot määritettiin ja niistä tehtiin tilastollinen analyysi. Taulukossa 4 on merkittävä ero (p<0.05) kahden luokan välisen ajan kaksinkertaistumisen osalta. Samoin määritettiin cd23 -, CD27-ja CD23+CD27+ – pitoisuuksien keskiarvot. Nopeasti kasvavilla LCLs: llä on korkeampi cd23: n ilmentymä (42,39%) verrattuna hitaasti kasvaviin LCLs: iin (35,28%). Tämä ei kuitenkaan ole tilastollisesti merkitsevää (Taulukko 4). Kääntäen CD27-ekspressio ja CD23/CD27-koekspressio olivat pienempiä nopeasti kasvavissa LCLs: issä (36, 15% ja 13, 36%, vastaavasti) verrattuna hitaasti kasvavissa LCLs: issä (51, 57% ja 19, 49%, vastaavasti). Tilastollista analyysia tehtäessä vain nopeasti kasvavat LCLs-arvot ovat huomattavasti alhaisempia CD27-lausekkeessa, mutta eivät CD23/CD27-lausekkeessa. Näiden havaintojen validoimiseksi tarvitaan lisätutkimuksia, joissa otoskoko on suurempi.
cd23: n voimakas ilmentyminen saattaa johtua EBV-infektiosta tai transformaatiosta. On olemassa todisteita siitä, että B-solujen kuolemattomuus saattaa perustua solun CD23-lausekkeeseen. Tutkimus osoitti, että EBV saattoi infektoida CD23-negatiivisia B-soluja, mutta niitä ei voitu ikuistaa, ellei niitä täydennetty erityisillä kasvutekijöillä . Toinen tutkimus osoitti, että EBV-tartunnan saaneet B-solut voivat kehittyä kahdeksi erilliseksi alapopulaatioksi: CD58+IL6 – ja CD58+IL6+ . Edellinen B-solujen alapopulaatio lisääntyi aktiivisesti, kun taas jälkimmäinen alapopulaatio lakkasi lisääntymästä. CD23: n ekspressio saattaa indusoitua myös EBV: n ydinantigeeni 2: n (EBNA-2) ekspressiolla sen jälkeen, kun B-solujen EBV-transformaatio on kuvattu aiemmin Burkittin lymfooman (BL) solulinjassa . Sen sijaan cd27: n suurempi ilmentyminen hitaasti kasvavissa LCLs: issä saattaa viitata niiden estävään vaikutukseen LCLs: n proliferaatiossa.
4. Päätelmät
CD23: lla voi olla stimuloiva rooli B-solujen EBV-muuntumisessa ja LCLs: n kasvussa. Tutkimuksemme osoittivat, että nopeasti kasvavilla LCLs: llä oli korkeampi CD23-lauseke ja alempi CD27-lauseke ja CD23CD27-lauseke. Lisätutkimukset suuremmalla otoskoolla ovat perusteltuja, jotta voidaan tutkia perusteellisesti pintamarkkeriekspression vaikutusta EBV: n ylläpitoon ja solujen kasvuun.
tietojen saatavuus
tämän tutkimuksen tulosten tueksi käytetyt tiedot on sisällytetty artikkeliin.
eturistiriidat
kirjoittajat ilmoittavat, ettei tämän artikkelin julkaisemiseen liity eturistiriitoja.
kiitokset
haluamme kiittää tohtori Alan Soo-Beng Khoota Molecular Pathology Unitista, Institute for Medical Research (IMR), Malesiasta, hänen anteliaisuudestaan toimittaessaan meille B95-8 marmoset-nimisen EBV: n immortalisointityöstämme. Hooi-Yeen Yap on saanut Sunway Universityn maisterintutkinnon Research Scholarship-stipendillä. Tätä tutkimusta rahoittivat Sunway University Internal Research Grant 2019 (INT-2019-SHMS-DMS-01), National Cancer Council Malaysia (MAKNA) Cancer Research Award (CRA) 2016 (EXT-kätkytkuolema-makna-2017-01) ja Sunway Medical Centre Research Funds (SRC/002/2017/FR ja SRC/003/2017/FR).
lisämateriaalit
taulukossa on esitetty tutkitut tapaukset, joissa diagnoosi, verinäytteenotto, pbmcs-kylmäsäilytys, EBV-kuolemattomuus ja kryosäilytettyjen PBMCs-yhdisteiden kesto. (Lisämateriaalit)