- Abstrakt
- 1. Introduksjon
- 2. Materialer og Metoder
- 2.1. Pasientprøver
- 2.2. Blodprøve og Sykdomsaktivitet Beregning
- 2.3. EBV Immortalization
- 2.4. Flowcytometrianalyse
- 2.5. Lcls Proliferation Assay
- 2.6. Statistisk Analyse
- 3. Resultater og Diskusjon
- 3.1. Sykdomsaktivitet Hos Forsøkspersoner
- 3.2. Generering Av LCLs
- 3.3. Vekstrate Og Dobling Tid Beregning Av Genererte LCLs
- 3.4. Overflate Markør Uttrykk For LCLs
- 3.5. Korrelasjon Av Sykdomsaktivitet, Overflatemarkøruttrykksnivå Og Lcl-Proliferasjon
- 4. Konklusjoner
- Datatilgjengelighet
- Interessekonflikter
- Takk
- Supplerende Materialer
Abstrakt
Epstein-Barr virus (EBV) Er en av de vanlige humane herpesvirus typer i verden. EBV er kjent for å infisere mer enn 95% av voksne i verden. Viruset infiserer hovedsakelig b-lymfocytter og kan forevige og forvandle cellene til EBV-bærende lymfoblastoide cellelinjer (LCLs). Begrensede studier har vært fokusert på å karakterisere overflaten markør uttrykk for immortalized LCLs. Denne studien demonstrerer genereringen av 15 LCLs fra seksten revmatoid artritt (RA) pasienter og en sunn frivillig ved Bruk Av B95-8 marmoset-avledet EBV. Suksessraten FOR lcl-generasjonen var 88.23%. ALLE CD19 + LCLs uttrykte CD23 (16,94-58,9%) og CD27 (15,74-80,89%) på celleoverflaten. Våre data viste to forskjellige kategorier Av LCLs (raskt og sakte voksende) (p<0.05) basert på deres doblingstid. De sakte voksende Lclene viste lavere CD23-nivå (35.28%) sammenlignet med raskt voksende LCLs (42.39%). I kontrast viste de sakte voksende Lclene høyere prosentandel i BÅDE CD27 alene og CD23 + CD27 + i kombinasjon. Samlet sett kan disse funnene foreslå korrelasjonene mellom cellulær CD23 og CD27-uttrykk med proliferasjonshastigheten til de genererte LCLs. Økning uttrykk FOR CD23 kan spille en rolle I EBV immortalization Av B-celler og vekst og vedlikehold AV EBV-transformert LCLs mens CD27 uttrykk kan ha hemmende effekter PÅ LCL spredning. Ytterligere undersøkelser er berettiget til disse spekulasjonene.
1. Introduksjon
Epstein-Barr virus (EBV) har smittet mer enn 95% voksne globalt . EBV retter seg hovedsakelig mot Og infiserer B-celler etterfulgt av epitelceller og I mindre grad CD4 T-celler . Infeksiøse virioner produseres etter lytisk replikasjon i B-celler og epitelceller. ETTER lytisk syklus FØLGER EBV latens og fortsetter i de infiserte b-cellene for resten av individets liv . EBV forårsaker hovedsakelig mononukleose, og DET er også nært forbundet med både lymfoide og epiteliale maligniteter som Burkitt lymfom, Hodgkins lymfom, nasofaryngeal karsinom og magekreft .
EBV infiserer B-celler og kan forevige b-cellene og danne langsiktige voksende LCLs som konsekvent uttrykker virusene . Denne metoden har blitt brukt i laboratorier for å udødeliggjøre visse humane blodavledede B-celler som senere kan brukes som en kulturmodell for ulike studier, inkludert storskala narkotikabibliotek screening, vaksinestudie og biologiske studier med høy gjennomstrømning . BLANT alle, EBV produsert Fra B95-8, en marmoset cellelinje, synes å være den mest vanlige OG potente EBV kilde For b-celle immortalization. I de siste tiårene har forskere forsøkt å forbedre immortaliseringsmetoden og dens effektivitet . Nylig har det blitt vist at Med en mindre modifikasjon kunne LCLs genereres fra et lite volum perifert blod så lavt som 0,1 mL . Dette funnet er spesielt nyttig under en omstendighet der prøvevolumet er begrenset.
tidligere studier har rapportert at immunceller spesielt B-celler og deres undergrupper spiller en sentral rolle i patogenesen AV RA . TIL tross for suksessen TIL EBV-immortalisering Av B-celler, har lite blitt gjort på karakteriseringen Av LCLs og dens sammenligning med foreldrenes b-celler. I denne studien viste VI at EBV effektivt kunne immortalisere B-celler fra ra-pasienters perifere blod og danne LCLs. Vi undersøkte deretter uttrykksnivåene for FLERE b-celler subpopulasjonsmarkører, inkludert CD23 OG CD27 i Både LCLs og deres foreldre B-celler. Disse b-celle subpopulasjonene har tidligere vært assosiert med klinisk presentasjon AV RA-pasienter. For eksempel har forhøyede b-celler som uttrykker CD23 blitt påvist HOS RA-pasienter, og de kan blokkeres av monoklonale antistoffer . På samme måte ble økt MENGDE CD27 + IgD-minne B-celler også lett detektert hos pasienter med aktiv RA . På Den annen side viste Hu og kollegaer AT CD27 + B-celler negativt korrelerte med SYKDOMSAKTIVITETEN TIL RA og ble funnet å være svekket hos pasientene .
i denne studien søkte vi å evaluere uttrykksnivået FOR CD23 og / ELLER CD27 Av b-celler fra Pbmc og LCLs avledet FRA RA-pasienter. Vi undersøkte også uttrykksnivået FOR CD23 OG CD27 med hensyn til Cellulær vekst Av LCLs.
2. Materialer og Metoder
2.1. Pasientprøver
5 ml perifert blod fra seksten RA-pasienter (Tabell 1) ble samlet inn Fra Sunway Medical Center, Malaysia, under en etisk godkjenningskode av 011/2017/ER. Pbmc ble isolert Ved Hjelp Av Ficoll-Paque (GE Healthcare) metode. Kort sagt ble blodet samlet i EDTA-rør fortynnet 1 til 1 med steril fosfatbufret saltvann (PBS) og lagret på Ficoll-Paque-oppløsning i et nytt sentrifugerør. Røret ble sentrifugert ved 400 xg i 40 minutter ved romtemperatur med lav akselerasjon og brems av. Topplaget som er plasma ble samlet og aliquotert før lagring ved -80°C. buffy-kappen som inneholdt Pbmcer ble samlet ved bruk av 3 ml Pasteur-pipette og overført til et nytt sentrifugerør. Cellene ble vasket to ganger med PBS etterfulgt av RPMI medium inneholdende 10% Føtalt Bovint Serum (FBS), før kryopreservert i 10% DMSO og lagret i flytende nitrogen lagertank. 5 ml blod ble donert fra en sunn frivillig som kontroll. Pbmc og plasma ble behandlet og lagret som beskrevet ovenfor. Datoen for diagnose, blodprøvetaking, pbmcs kryopreservering og EBV-immortalisering er vist I Tilleggsmaterialer (tilgjengelig her).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Anti-CCP: anti-syklisk citrullinert peptidantistoff; CRP: C-reaktivt protein; DAS28: sykdomsaktivitet score 28; ESR: erytrocytt sedimenteringshastighet; RF: reumatoid faktor.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2.2. Blodprøve og Sykdomsaktivitet Beregning
2.3. EBV Immortalization
b95-8 marmoset-avledet EBV supernatant var en snill gave fra Dr. Alan Soo-Beng Khoo, Molecular Pathology unit, Institute For Medical Research (IMR), Malaysia. B-celler fra pasientens perifere blod ble udødeliggjort ved bruk AV den konsentrerte EBV-supernatanten som tidligere beskrevet . Tabellen I Supplerende Materialer viser datoen FOR pbmc-isolasjon og kryopreservering, lcls-etablering og varighet av kryopreserverte Pbmcer lagret i flytende nitrogenlagertank. Kort sagt ble et hetteglass med tidligere kryopreservert PBMC tint ut og cellenummeret ble bestemt. Cellene ble justert til 2 x 106 / mL ved bruk av fersk tint EBV supernatant og inkubert over natten ved 37°C, 5% CO2 i en stående t25-kolbe. Neste dag ble transformasjonsmedium (RPMI 1640 + 20% FBS + 200ng/ml syklosporin) tilsatt i kolben. DE EBV-infiserte cellene ble observert under mikroskopet for å lete etter rosettlignende transformerte LCLs i klynger. LCLs i passasjer 3-6 ble brukt til flowcytometrianalyse og celleproliferasjonsanalyse.
2.4. Flowcytometrianalyse
trefarget cytometri ble utført På FACSCalibur flowcytometer (Becton Dickinson) ved bruk av monoklonale antistoffer som identifiserer overflateantigener For T-celler (CD3/PE, klon SK7), B-celler (CD19/BB515, HIB19) og b-celleundergrupper (CD23/APC, KLON EBV-CS5 og CD27/PE, klon L128). Cell viability solution 7AAD (VIA-PROBE) ble kjøpt for å bestemme cellens levedyktighet. Alle antistoffer ble kjøpt Fra Becton Dickinson. Kort tid ble kryopreserverte Pbmcer tint og resuspendert i 50µ av Bsa-flekkbuffer (Becton Dickinson) og inkubert ved romtemperatur i mørket med prediluted fluorokrom-konjugerte antistoffer i 30 minutter. Pbmc – ene ble deretter vasket to ganger med bsa-flekkbuffer og resuspendert i 500µ AV BSA-buffer for flowcytometrianalyse. Kontroll PBMC suspensjoner ble utarbeidet med samme prosedyre. 20 000 levedyktige celler bestemt av celleviabilitetsfargen ble gated og samlet for trefargeanalyse VED sett MED CD3 / CD19 / CD23 og CD19/CD27/CD23. Data ble analysert ved Hjelp Av CellQuest Pro programvare (Becton Dickinson).
2.5. Lcls Proliferation Assay
for å skille LCLs i to kategorier (rask og sakte voksende) ble celleproliferasjonshastigheten bestemt ved Hjelp Av Realtime-Glo MT cell viability assay (Promega) etter produsentens instruksjon. Dette er en nonlytisk luminescensbasert analyse som kan oppdage sanntids spredning av levende celler i kultur opptil 72 timer. Kort sagt ble 10.000 celler/brønn sådd på en hvit flatbunns 96-brønnplate (Greiner Bio-one) i tre eksemplarer. 2x reaksjonsblanding ble fremstilt fra det medfølgende settet og tilsatt til hver brønn. Cellene ble inkubert ved 37°C, 5% CO2 i 1 time før målingen ble tatt på forskjellige tidspunkter (0, 16, 20, 24, 40, 44, 48, 64, 68, 72 timer) ved hjelp av en luminescens microplate reader (Tecan). Den relative luminescens enheter (RLUs) versus tid grafen ble plottet for å vise vekstkurven Av LCLs. I denne grafen ble cellenummeret representert av RLUs. Ved Hjelp Av RLUs ble doblingstiden (tiden som kreves for at et celletall skal doble i verdi) av hver Kategori Av LCLs beregnet ved hjelp av en multipoint online kalkulator som ble brukt til signifikansprøver . Dette nettbaserte verktøyet bruker minste kvadraters eksponentielle metode for å beregne doblingstiden . Vekstraten (antall doblinger som forekommer per tidsenhet) ble deretter beregnet ved hjelp av formelen nedenfor: gjennomsnittsverdien av alle LCLs doblingstid var 54,69 timer. Derfor ble denne verdien brukt som cutoff og LCLs med doblingstid høyere enn 54.69 timer ble gruppert i sakte voksende LCLs og omvendt for raskt voksende LCLs.
2.6. Statistisk Analyse
Flowcytometri analyse ble utført i tre uavhengige eksperimenter for hver Kategori Av LCLs, med mindre annet er spesifisert. Data ble uttrykt i middelverdier standardavvik (std. dev). Signifikans ble bestemt ved bruk av ikke-parametriske tester (Mann-Whitney Og Kruskal-Wallis H) der dataene anses å være signifikante når p er mindre enn 0,05.
3. Resultater og Diskusjon
3.1. Sykdomsaktivitet Hos Forsøkspersoner
Tabell 1 viser demografiske data fra seksten RA-pasienter og en frisk person og deres blodprøveresultater fra VANLIGE RA – diagnostiske markører som indikerer deres sykdomsaktivitet. BASERT PÅ das28-CRP-indeksen for 16 RA-pasienter ble 3 av disse pasientene klassifisert som høy sykdomsaktivitet, 8 som moderat aktivitet, 3 som remisjon, og de resterende to som ukjent status på grunn av ufullstendig datainnsamling.
3.2. Generering Av LCLs
Pbmc ble høstet fra seksten RA-pasienter og en frisk donor (merket Som C) (Tabell 1) og kryopreservert. Alikvoter av kryopreserverte Pbmcer ble deretter brukt mot EBV-infeksjon. Av de sytten kolber ble 15 EBV-transformerte LCLs (unntatt 4E og 14A) generert en uke etter infeksjon der synlige celleklynger ble sett fra kolber. Når visualisert under mikroskop, lcls viste typisk rosett morfologi med ulike størrelser som indikert av de røde pilene (Figur 1). Suksessraten For LCLs-generasjonen var 88,23% (15 av 17).
3.3. Vekstrate Og Dobling Tid Beregning Av Genererte LCLs
vi deretter bestemt vekstraten for hver generert Kategori Av LCLs ved hjelp av en nonlytic og sanntids luminescens-basert celleproliferasjon assay. Figur 2 viser vekstkurven for hver Kategori Av LCLs representert ved de relative luminescens enheter (RLUs). Tabell 2 viser beregnet doblingstid og vekstrate for respektive LCLs ved hjelp av en online kalkulator . Fra den oppnådde doblingstiden for hver Kategori Av LCLs deler Vi Lclene i to kategorier ved hjelp av 54.69 timer (gjennomsnittsverdi av Alle LCLs) som grenseverdi, noe som resulterte i 10 raskt voksende Og 5 sakte voksende LCLs (Tabell 2 og 4) (p<0,05).
3.4. Overflate Markør Uttrykk For LCLs
Pbmc og tilsvarende LCLs ble utsatt for flowcytometri analyse for å bestemme deres overflate markør uttrykk INKLUDERT CD3, CD19, CD23 OG CD27. CD3 OG CD19 er overflatemarkører for henholdsvis t-celler og B-celler. Ved å bruke Pbmc isolert fra pasient 8A og tilhørende LCL-8A som eksempler, Viser Figur 3 hvordan CD3 + T-cellene og CD19 + B-cellene ble profilert og styrt av flowcytometri. Ekspresjonsnivået ble deretter presentert i prosent fra det totale antallet analyserte lymfocytter som var 20 000 celler. I givernes Pbmcer var 29,78-81,8% T-celler, mens 2,35-45,95% utgjør B-celler. Etter EBV-transformasjonen ble T-cellepopulasjoner redusert til 0-0, 27% mens b-cellepopulasjoner økte til 68, 59-89, 35%. Dette indikerer tydelig suksessen Til b-celle immortalization AV EBV som har tatt Over t-celle populasjonen. CD3 + T-celler senesced og ville bli helt vasket av Fra LCLs.
CD23 er en b-celle aktiveringsmarkør mens CD27 er en markør for minne B-celler . Hos RA-pasienter har forhøyede NIVÅER AV CD23-uttrykkende B-celler tidligere blitt rapportert å korrelere positivt med sykdomsaktiviteten, og de kan potensielt tjene som et terapeutisk mål . I kontrast BLE CD27 + B-celler funnet å korrelere negativt med sykdomsaktivitet og funnet å være svekket hos RA-pasienter . I den nåværende studien kunne vi ikke skille uttrykksmønsteret FOR CD23 og CD27 i PBMCs og LCLs(Tabell 3). Figur 4 viser gating AV CD19+, CD23 + OG CD27 + fra Pbmc isolert fra pasient 8A og den tilsvarende LCL-8A ved flowcytometri. Fra Alle LCLs, mens 68.59-89.35% VAR CD19+ som forventet, viser de uttrykk FOR CD23 (16.94-58.9%) OG CD27 (15.74-80.89%). B-celler som koekspresserte CD23 og CD27 var 5,72-41,53% (Tabell 3).
3.5. Korrelasjon Av Sykdomsaktivitet, Overflatemarkøruttrykksnivå Og Lcl-Proliferasjon
en statistisk analyse ble utført For å teste korrelasjonen mellom sykdomsaktiviteten og overflatemarkøruttrykk; imidlertid viste ingen av dem betydning. På samme måte korrelerte sykdomsaktiviteten ikke med vekstraten for tilsvarende LCLs.
fra doblingstiden for Hver Kategori Av LCLs ble middelverdier for både raskt og sakte voksende LCLs bestemt og utsatt for statistisk analyse. Tabell 4 viser en signifikant forskjell (p< 0.05) i form av dobling tid mellom de to kategoriene. På samme måte ble middelverdiene FOR CD23 -, CD27-og CD23+CD27+ – nivåene i den respektive kategorien bestemt. De raskt voksende LCLs har høyere uttrykk FOR CD23 (42.39%) sammenlignet med de sakte voksende LCLs (35.28%). Dette er imidlertid ikke statistisk signifikant (Tabell 4). OMVENDT VAR CD27-uttrykk og CD23 / CD27-kouttrykk lavere i de raskt voksende Lclene (henholdsvis 36,15 og 13,36%) sammenlignet med de sakte voksende Lclene (henholdsvis 51,57% og 19,49%). Når en statistisk analyse utføres, viser bare de raskt voksende LCLs betydelig lavere I CD27, men IKKE CD23/CD27-uttrykk. Videre studier med større utvalgsstørrelse er nødvendig for å validere disse funnene.
DET høye uttrykket FOR CD23 kan skyldes EBV-infeksjon eller transformasjon. Det er bevis som viser At b-celle immortalization kan stole på cellular CD23 uttrykk. STUDIEN viste AT CD23-negative b-celler kunne bli infisert av EBV, men kunne ikke bli immortalized med mindre supplere med spesifikke vekstfaktorer . EN annen studie viste AT EBV-infiserte B-celler kunne utvikle seg til TO forskjellige subpopulasjoner: CD58 + IL6 – OG CD58 + IL6+. Den Tidligere B-celle subpopulation aktivt proliferated mens sistnevnte subpopulation sluttet å proliferere. Uttrykket AV CD23 kan også induseres AV EBV nukleært antigen 2 (EBNA-2) uttrykk etter EBV transformasjon Av B-celler som tidligere beskrevet I En Burkitt lymfom (BL) cellelinje . I kontrast kan det høyere uttrykket AV CD27 i sakte voksende LCLs foreslå deres hemmende effekter på LCLs’ spredning.
4. Konklusjoner
CD23 kan spille en stimulerende rolle I EBV-transformasjon Av B-celler og LCLs’ vekst. Våre studier viste at de raskt voksende LCLs viste høyere CD23-uttrykk og lavere CD27-uttrykk og CD23CD27-uttrykk. Videre studier med større utvalgsstørrelse er garantert å undersøke i dybden på implikasjonen av overflatemarkøruttrykket på EBV-vedlikehold og cellulær vekst.
Datatilgjengelighet
dataene som brukes til å støtte funnene i denne studien, er inkludert i artikkelen.
Interessekonflikter
forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikter angående publisering av denne artikkelen.
Takk
Vi vil gjerne takke Dr. Alan Soo-Beng Khoo Fra Molecular Pathology Unit, Institute FOR Medical Research (IMR), Malaysia, for hans generøsitet i å forsyne Oss Med B95-8 marmoset-avledet EBV for vårt immortalization arbeid. Hooi-Yeen Yap er mottaker Av Sunway University Mastergrad Ved Forskningsstipend. Denne forskningen ble finansiert Av Sunway University Intern Forskningsstipend 2019 (INT-2019-SHMS-dms-01), National Cancer Council Malaysia (MAKNA) Cancer Research Award (CRA) 2016 (EXT-SIDS-SIHD-MAKNA-2017-01), Og Sunway Medical Center Forskningsmidler (SRC/002/2017/FR og SRC/003/2017/FR).
Supplerende Materialer
tabellen viser de studerte tilfellene med diagnosedato, blodprøvetaking, pbmc-kryopreservering, EBV-immortalisering og varighet av kryopreserverte Pbmc-er. (Supplerende Materialer)