Virus de Epstein-Barr (VEB) Las Líneas Celulares Linfoblastoides inmortalizadas (LCLs) Expresan un Alto Nivel de CD23 pero Bajo de CD27 para apoyar Su Crecimiento

Resumen

El virus de Epstein – Barr (VEB) es uno de los tipos de herpesvirus humanos comunes en el mundo. Se sabe que el VEB infecta a más del 95% de los adultos en el mundo. El virus infecta principalmente los linfocitos B y podría inmortalizar y transformar las células en líneas celulares linfoblastoides portadoras de VEB (LCLs). Estudios limitados se han centrado en caracterizar la expresión de marcadores de superficie de las LCLs inmortalizadas. Este estudio demuestra la generación de 15 LCLs a partir de dieciséis pacientes con artritis reumatoide (AR) y un voluntario sano que utilizó VEB derivado del tití B95-8. La tasa de éxito de la generación de LCL fue del 88,23%. Todos CD19+ LCLs expresó CD23 (16.94-58,9%) y CD27 (15.74-80.89%) en la superficie celular. Nuestros datos demostraron dos categorías distintas de LCLs (de crecimiento rápido y lento) (p<0,05) en función de su tiempo de duplicación. Los LCLS de crecimiento lento mostraron un nivel de CD23 más bajo (35,28%) en comparación con los LCLs de crecimiento rápido (42,39%). En contraste, las LCLS de crecimiento lento mostraron un porcentaje más alto tanto en CD27 solo como en CD23 + CD27 + en combinación. En general, estos hallazgos pueden sugerir las correlaciones de la expresión celular de CD23 y CD27 con la tasa de proliferación de las LCLs generadas. El aumento de la expresión de CD23 puede desempeñar un papel en la inmortalización del VEB de las células B y en el crecimiento y mantenimiento de las LCLs transformadas por el VEB, mientras que la expresión de CD27 puede tener efectos inhibitorios en la proliferación de LCL. Se justifican más investigaciones para estas especulaciones.

1. Introducción

El virus de Epstein-Barr (VEB) ha infectado a más del 95% de los adultos en todo el mundo . El VEB se dirige e infecta principalmente a las células B, seguidas de las células epiteliales y, en menor medida, a las células T CD4 . Los viriones infecciosos se producen tras la replicación lítica en células B y células epiteliales. Después del ciclo lítico, la latencia del VEB sigue y persiste en las células B infectadas por el resto de la vida del individuo . El VEB causa principalmente mononucleosis infecciosa y también está estrechamente relacionado con neoplasias malignas tanto linfoides como epiteliales, como el linfoma de Burkitt, el linfoma de Hodgkin, el carcinoma nasofaríngeo y el cáncer gástrico .

El VEB infecta las células B y podría inmortalizar las células B y formar LCLS en crecimiento a largo plazo que expresan consistentemente los virus . Este método se ha utilizado en laboratorios para inmortalizar ciertas células B derivadas de la sangre humana que se pueden usar más tarde como modelo de cultivo para varios estudios, incluidos la detección de bibliotecas de medicamentos a gran escala, el estudio de vacunas y los estudios biológicos de alto rendimiento . Entre todos, el VEB producido a partir de B95-8, una línea celular de titíes, parece ser la fuente de VEB más común y potente para la inmortalización de células B. En las últimas décadas, los investigadores se han esforzado por mejorar el método de inmortalización y su eficiencia . Recientemente, se ha demostrado que con una modificación menor, LCLs podría generarse a partir de un pequeño volumen de sangre periférica tan bajo como 0,1 ml . Este hallazgo es particularmente útil en una circunstancia en la que el volumen de muestra es limitado.

En estudios anteriores se ha informado de que las células inmunitarias, en particular las células B y sus subconjuntos, desempeñan un papel fundamental en la patogénesis de la artritis reumatoide . A pesar del éxito de la inmortalización del VEB de las células B, poco se ha hecho en la caracterización de las LCLs y su comparación con las células B parentales. En este estudio, demostramos que el VEB podía inmortalizar eficientemente las células B de la sangre periférica de los pacientes con AR y formar LCLs. A continuación, examinamos los niveles de expresión de varios marcadores de subpoblación de células B, incluidos CD23 y CD27, tanto en LCLs como en sus células B parentales. Estas subpoblaciones de células B se han asociado previamente con la presentación clínica de los pacientes con AR. Por ejemplo, se han detectado células B elevadas que expresan CD23 en pacientes con AR y podrían ser bloqueadas por anticuerpos monoclonales . De manera similar, también se detectó fácilmente un aumento de la cantidad de células B de memoria IgD CD27+en pacientes con AR activa . Por otro lado, Hu y compañeros de trabajo demostraron que las células B CD27+ se correlacionaron negativamente con la actividad de la enfermedad de la AR y se encontró que estaban deterioradas en los pacientes .

En este estudio, se buscó evaluar el nivel de expresión de CD23 y / o CD27 de células B de las PBMCs y LCLs derivadas de pacientes con AR. También investigamos el nivel de expresión de CD23 y CD27 con respecto al crecimiento celular de LCLs.

2. Materiales y Métodos

2.1. Muestras de pacientes

5 ml de sangre periférica de dieciséis pacientes con artritis reumatoide (Tabla 1) se recogieron en Sunway Medical Centre, Malasia, bajo un código de aprobación ética de 011/2017/ER. Los PBMC se aislaron utilizando el método Ficoll-Paque (GE Healthcare). Brevemente, la sangre recolectada en el tubo de EDTA se diluyó de 1 a 1 con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) y se superpuso a la solución de Ficoll-Paque en un tubo de centrífuga fresco. El tubo se centrifugó a 400 xg durante 40 minutos a temperatura ambiente con baja aceleración y ‘freno apagado ‘. La capa superior que es el plasma se recogió y alícuota antes de almacenarse a -80°C. La capa buffy que contenía PBMCs se recogió con una pipeta Pasteur de 3 ml y se transfirió a un tubo de centrífuga fresco. Las células se lavaron dos veces con PBS seguido de un medio RPMI que contenía un 10% de Suero Fetal Bovino (FBS), antes de crioconservarse en un 10% de DMSO y almacenarse en un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido. Se donaron 5 ml de sangre de un voluntario sano como control. Los PBMCS y el plasma se procesaron y almacenaron como se describió anteriormente. La fecha del diagnóstico, la toma de muestras de sangre, la criopreservación de PBMCs y la inmortalización del VEB se muestran en Materiales complementarios (disponibles aquí).

2.2. Análisis de Sangre y Cálculo de la Actividad de la Enfermedad

2.3. Inmortalización del VEB

El sobrenadante derivado del VEB B95-8 fue un regalo amable del Dr. Alan Soo-Beng Khoo, Unidad de Patología Molecular, Instituto de Investigación Médica (IMR), Malasia. Las células B de la sangre periférica del paciente se inmortalizaron utilizando el sobrenadante concentrado del VEB como se describió anteriormente . La tabla de Materiales Suplementarios muestra la fecha de aislamiento y criopreservación de PBMC, el establecimiento de LCLs y la duración de los PBMC criopreservados almacenados en el tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido. Brevemente, se descongeló un vial de PBMC previamente criopreservado y se determinó el número de células. Las células se ajustaron a 2 x 106/ml con sobrenadante del VEB recién descongelado y se incubaron durante la noche a 37°C, con un 5% de CO2 en un matraz T25 en pie. Al día siguiente, se añadió al matraz un medio de transformación (RPMI 1640 + 20% FBS + 200 ng/ml de ciclosporina). Las células infectadas por el VEB se observaron al microscopio para buscar células LCLs transformadas en forma de roseta en racimos. Se utilizaron LCLs en pasajes 3-6 para el análisis de citometría de flujo y el ensayo de proliferación celular.

2.4. Se realizó un análisis de citometría de Flujo

Se realizó una citometría tricolor en el citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson) utilizando anticuerpos monoclonales que identificaban antígenos de superficie para células T (CD3/PE, clon SK7), células B (CD19/BB515, HIB19) y subconjuntos de células B (CD23/APC, clon EBV-CS5 y CD27/PE, clon L128). La solución de viabilidad celular 7AAD (VÍA SONDA) se compró para determinar la viabilidad celular. Todos los anticuerpos fueron comprados a Becton Dickinson. Brevemente, las PBMC criopreservadas se descongelaron y resuspendieron en 50 µl de tampón de tinción de BSA (Becton Dickinson) y se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad con anticuerpos conjugados fluorocromo prediluidos durante 30 minutos. Los PBMC se lavaron dos veces con tampón de manchas de ASC y se resuspendieron en 500 µl de tampón de ASC para el análisis de citometría de flujo. Las suspensiones PBMC de control se prepararon con el mismo procedimiento. se seleccionaron 20.000 células viables determinadas por el tinte de viabilidad celular y se recogieron para el análisis de tres colores en series de CD3 / CD19/CD23 y CD19/CD27 / CD23. Los datos se analizaron con el software CellQuest Pro (Becton Dickinson).

2.5. Ensayo de proliferación de LCLs

Para separar los LCLs en dos categorías (de crecimiento rápido y lento), la tasa de proliferación celular se determinó utilizando el ensayo de viabilidad celular Glo MT en tiempo real (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. Este es un ensayo basado en luminiscencia no lítica que puede detectar la proliferación en tiempo real de células vivas en cultivo hasta 72 horas. En pocas palabras, se sembraron 10.000 células/pocillo en una placa blanca de fondo plano de 96 pocillos (Greiner Bio-one) por triplicado. Se preparó 2 mezclas de reacción a partir del kit proporcionado y se agregaron a cada pozo. Las células se incubaron a 37 ° C, 5% de CO2 durante 1 hora antes de tomar la medición en diferentes momentos (0, 16, 20, 24, 40, 44, 48, 64, 68, y 72 horas) utilizando un lector de microplacas de luminiscencia (Tecan). Se trazaron las unidades de luminiscencia relativa (ULR) frente al gráfico de tiempo para mostrar la curva de crecimiento de las LCLs. En este gráfico, el número de celda estaba representado por el RLUs. Usando el RLUs, el tiempo de duplicación (tiempo requerido para que un número de celda duplicara su valor) de cada categoría de LCLs se calculó utilizando una calculadora en línea multipunto que se utilizó para las pruebas de significación . Esta herramienta en línea utiliza el método exponencial de ajuste de mínimos cuadrados para calcular el tiempo de duplicación . La tasa de crecimiento (número de duplicaciones que se producen por unidad de tiempo) se calculó utilizando la siguiente fórmula:El valor medio del tiempo de duplicación de todos los LCLs fue de 54,69 horas. Por lo tanto, este valor se utilizó como punto de corte y LCLs con un tiempo de duplicación superior a 54.69 horas se agruparon en LCLS de crecimiento lento y viceversa para LCLs de crecimiento rápido.

2.6. Análisis estadístico

El análisis de citometría de flujo se realizó en tres experimentos independientes para cada categoría de LCLs, a menos que se especifique lo contrario. Los datos se expresaron en valores medios de desviación estándar (std. dev). La significación se determinó mediante pruebas no paramétricas (Mann-Whitney y Kruskal-Wallis H) en las que los datos se consideran significativos cuando p es inferior a 0,05.

3. Resultados y Discusión

3.1. Actividad de la enfermedad de los sujetos del estudio

La tabla 1 muestra los datos demográficos de los dieciséis pacientes con AR y un individuo sano, así como los resultados de los análisis de sangre de los marcadores diagnósticos de AR comúnmente utilizados que indican sus actividades de la enfermedad. Con base en el índice DAS28-PCR de 16 pacientes con AR, 3 de estos pacientes se clasificaron como alta actividad de la enfermedad, 8 como actividad moderada, 3 como remisión y los dos restantes como estado desconocido debido a la recolección de datos incompleta.

3.2. La generación de LCLs

PBMC se cosechó de los dieciséis pacientes con AR y un donante sano (marcado como C) (Tabla 1) y criopreservados. Se utilizaron alícuotas de PBMCS criopreservadas para la infección por VEB. De los diecisiete frascos, 15 LCLs transformadas por VEB (excepto 4E y 14A) se generaron una semana después de la infección, en la que se observaron grupos de células visibles desde los frascos. Cuando se visualizaron al microscopio, los LCLs mostraron una morfología de roseta típica con varios tamaños, como lo indican las flechas rojas (Figura 1). La tasa de éxito de la generación de LCLs fue del 88,23% (15 de 17).

Gráfico 1

Examen microscópico de células B inmortalizadas por VEB derivadas de PBMC de un paciente con AR 8A una semana después de la infección. Estas celdas inmortalizadas están anotadas como LCL-8A. Las flechas rojas muestran las LCL inmortalizadas por VEB en forma de roseta con aumentos de 4x (panel superior), 10x (panel central) y 20x (panel inferior). Las barras de escala se indican en amarillo.

3.3. Cálculo de la Tasa de crecimiento y el Tiempo de duplicación de LCLs Generadas

Luego determinamos la tasa de crecimiento de cada categoría de LCLs generada utilizando un ensayo de proliferación celular basado en luminiscencia no lítica y en tiempo real. La Figura 2 muestra la curva de crecimiento de cada categoría de LCLs representada por las unidades de luminiscencia relativa (ULR). La tabla 2 muestra el tiempo de duplicación calculado y la tasa de crecimiento de las LCLs respectivas utilizando una calculadora en línea . A partir del tiempo de duplicación obtenido de cada categoría de LCLs, dividimos las LCLs en dos categorías utilizando 54.69 horas (valor medio de todos los LCLs) como valor de corte, lo que resultó en 10 LCLs de crecimiento rápido y 5 de crecimiento lento (Tablas 2 y 4) (p<0,05).

Figura 2

curvas de Crecimiento de LCLs. Las unidades de luminiscencia relativa representan las señales de viabilidad de las células en varios puntos de tiempo. Las líneas rellenas representan las LCLs de crecimiento rápido, mientras que las líneas punteadas representan las LCLs de crecimiento lento.

3.4. Expresión de marcadores de superficie de LCLs

PBMC y LCLs correspondientes se sometieron a análisis de citometría de flujo para determinar su expresión de marcadores de superficie, incluidos CD3, CD19, CD23 y CD27. CD3 y CD19 son marcadores de superficie para las células T y las células B, respectivamente. Utilizando los PBMC aislados del paciente 8A y el LCL-8A correspondiente como ejemplos, la Figura 3 muestra cómo se perfilaron y bloquearon las células T CD3+ y las células B CD19+ mediante citometría de flujo. El nivel de expresión se presentó en porcentaje del número total de linfocitos analizados, que eran 20.000 células. En las CMPB de los donantes, 29,78-81,8% eran células T, mientras que 2,35-45,95% eran células B. Después de la transformación del VEB, las poblaciones de células T se redujeron a 0-0, 27%, mientras que las poblaciones de células B aumentaron a 68,59-89,35%. Esto indica claramente el éxito de la inmortalización de células B por el VEB, que se ha apoderado de la población de células T. Células T CD3 + senesced y se lavarían completamente de los LCLs.

Gráfico 3

Perfilado de marcadores de superficie de células T (CD3) y células B (CD19) por citometría de flujo. El panel superior muestra el análisis de PBMCS aisladas del paciente 8A, mientras que el panel inferior muestra el análisis de las LCLS correspondientes (LCL-8A). R1: células vivas 7AAD; R2: linfocitos cerrados; R3: células T CD3 + cerradas; R4: células B CD19 + cerradas.

CD23 es un marcador de activación de células B, mientras que CD27 es un marcador de células B de memoria . En pacientes con AR, se ha notificado previamente que niveles elevados de células B que expresan CD23 se correlacionan positivamente con la actividad de la enfermedad y podrían servir potencialmente como diana terapéutica . Por el contrario, se encontró que las células B CD27+ se correlacionaban negativamente con la actividad de la enfermedad y se encontraron deterioradas en pacientes con AR . En el presente estudio, no pudimos diferenciar el patrón de expresión de CD23 y CD27 en PBMC y LCLs (Tabla 3). En la Figura 4 se muestra la compuerta de CD19+, CD23 + y CD27 + de los PBMCS aislados del paciente 8A y el LCL-8A correspondiente por citometría de flujo. De todas las LCLs, mientras que el 68,59-89,35% eran CD19+ como se esperaba, exhiben expresión de CD23 (16,94-58,9%) y CD27 (15,74-80,89%). Las células B que coexpresaban CD23 y CD27 fueron del 5,72 al 41,53% (Tabla 3).

3.5. Correlación de la Actividad de la Enfermedad, Nivel de Expresión de los Marcadores de Superficie y Proliferación de LCL

Se realizó un análisis estadístico para probar la correlación entre la actividad de la enfermedad y las expresiones de los marcadores de superficie; sin embargo, ninguna de ellas mostró significación. De manera similar, la actividad de la enfermedad no se correlacionó con la tasa de crecimiento de las LCLs correspondientes.

A partir del tiempo de duplicación de cada categoría de LCLs, se determinaron los valores medios para LCLs de crecimiento rápido y lento y se sometieron a análisis estadístico. La Tabla 4 muestra una diferencia significativa (p< 0.05) en términos de tiempo de duplicación entre las dos categorías. De manera similar, se determinaron los valores medios de los niveles de CD23, CD27 y CD23+CD27+ de la categoría respectiva. Las LCLs de crecimiento rápido tienen una expresión más alta de CD23 (42,39%) en comparación con las LCLs de crecimiento lento (35,28%). Sin embargo, esto no es estadísticamente significativo (Tabla 4). A la inversa, la expresión de CD27 y la coexpresión de CD23/CD27 fueron menores en las LCLS de crecimiento rápido (36,15 y 13,36%, respectivamente) en comparación con las LCLs de crecimiento lento (51,57% y 19,49%, respectivamente). Cuando se realiza un análisis estadístico, solo las LCLS de rápido crecimiento muestran una expresión significativamente menor de CD27, pero no de CD23/CD27. Se requieren más estudios con un tamaño de muestra más grande para validar estos hallazgos.

La alta expresión de CD23 puede deberse a la infección o transformación del VEB. Hay evidencia que muestra que la inmortalización de células B podría depender de la expresión celular CD23. El estudio demostró que las células B CD23 negativas podían infectarse por el VEB, pero no podían inmortalizarse a menos que se complementaran con factores de crecimiento específicos . Otro estudio mostró que las células B infectadas por el VEB podrían desarrollarse en dos subpoblaciones distintas: CD58 + IL6 – y CD58 + IL6+. La primera subpoblación de células B proliferó activamente, mientras que la segunda dejó de proliferar. La expresión de CD23 también puede ser inducida por la expresión del antígeno nuclear 2 del VEB (EBNA-2) después de la transformación del VEB de las células B, como se describió anteriormente en una línea celular de linfoma de Burkitt (LB). En contraste, la mayor expresión de CD27 en LCLs de crecimiento lento puede sugerir sus efectos inhibitorios en la proliferación de LCLs.

4. Conclusiones

CD23 podría desempeñar un papel estimulante en la transformación del VEB de las células B y en el crecimiento de las células LCLs. Nuestros estudios mostraron que los LCLs de rápido crecimiento exhibían una expresión de CD23 más alta y una expresión de CD27 y expresión de CD23CD27 más baja. Se justifican estudios adicionales con un tamaño de muestra más grande para investigar en profundidad la implicación de la expresión de marcadores de superficie en el mantenimiento del VEB y el crecimiento celular.

Disponibilidad de los datos

Los datos utilizados para apoyar los hallazgos de este estudio se incluyen en el artículo.

Conflictos de intereses

Los autores declaran que no existen conflictos de intereses con respecto a la publicación de este artículo.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer al Dr. Alan Soo-Beng Khoo de la Unidad de Patología Molecular, Instituto de Investigación Médica (IMR), Malasia, por su generosidad al proporcionarnos el VEB derivado del tití B95-8 por nuestro trabajo de inmortalización. Hooi-Yeen Yap recibió una Maestría de la Universidad Sunway por Beca de Investigación. Esta investigación fue financiada por la Beca de Investigación Interna de la Universidad Sunway 2019 (INT-2019-SHMS-DMS-01), el Premio de Investigación del Cáncer (CRA) del Consejo Nacional del Cáncer de Malasia (MAKNA) 2016 (EXT-SIDS-SIHD-MAKNA-2017-01) y los Fondos de Investigación del Centro Médico Sunway (SRC/002/2017/FR y SRC/003/2017/FR).

Materiales suplementarios

La tabla muestra los casos estudiados con fecha de diagnóstico, muestreo de sangre, criopreservación de PBMCs, inmortalización del VEB y duración de las PBMCS criopreservadas. (Materiales complementarios)