Epstein-Barr vírus – (EBV-) az immortalizált Limfoblasztoid sejtvonalak (LCLs) magas Cd23-szintet, de alacsony CD27-et fejeznek ki növekedésük támogatására

absztrakt

az Epstein-Barr vírus (EBV) az egyik leggyakoribb humán herpeszvírus típus a világon. Az EBV-ről ismert, hogy a felnőttek több mint 95% – át megfertőzi a világon. A vírus elsősorban a B-limfocitákat fertőzi meg, és halhatatlanná teheti és átalakíthatja a sejteket EBV-t hordozó limfoblasztoid sejtvonalakká (LCLs). Korlátozott tanulmányok összpontosítottak az immortalizált LCLs felületi marker expressziójának jellemzésére. Ez a tanulmány tizenhat rheumatoid arthritisben (RA) szenvedő beteg és egy B95-8 selyemmajomból származó EBV-t használó egészséges önkéntes 15 LCLs generációját mutatja be. Az LCL generáció sikerességi aránya 88,23% volt. Az összes CD19 + LCLs cd23-at (16,94-58,9%) és CD27-et (15,74-80,89%) expresszált a sejtfelszínen. Adataink az LCLs két különböző kategóriáját mutatták (gyors és lassú növekedés) (p<0,05) a megduplázódási idő alapján. A lassan növekvő LCLs alacsonyabb CD23 szintet (35,28%) mutatott, mint a gyorsan növekvő LCLs (42,39%). Ezzel szemben a lassan növekvő LCLs magasabb százalékot mutatott mind a CD27 önmagában, mind a CD23+CD27+ kombinációban. Összességében ezek az eredmények arra utalhatnak, hogy a sejtes CD23 és CD27 expresszió összefügg a generált LCLs proliferációs sebességével. A CD23 expressziójának növekedése szerepet játszhat a B-sejtek EBV immortalizációjában és az EBV-transzformált LCLs növekedésében és fenntartásában, míg a CD27 expresszió gátló hatással lehet az LCL proliferációra. További vizsgálatok indokoltak ezekre a spekulációkra.

1. Bevezetés

az Epstein-Barr vírus (EBV) a felnőttek több mint 95% – át fertőzte meg világszerte . Az EBV elsősorban a B-sejteket célozza meg és fertőzi meg, majd a hámsejteket és kisebb mértékben a CD4 T-sejteket . A fertőző virionok a litikus replikáció után keletkeznek a B-sejtekben és a hámsejtekben. A litikus ciklus után az EBV késleltetés következik be, és a fertőzött B-sejtekben az egyén életének hátralévő részében fennmarad . Az EBV elsősorban fertőző mononukleózist okoz, és szorosan kapcsolódik mind a limfoid, mind az epitheliális rosszindulatú daganatokhoz, mint például a Burkitt-limfóma, a Hodgkin-limfóma, a nasopharyngealis carcinoma és a gyomorrák .

az EBV megfertőzi a B-sejteket, és képes halhatatlanná tenni a B-sejteket, és hosszú távon növekvő LCI-ket képezni, amelyek következetesen expresszálják a vírusokat . Ezt a módszert laboratóriumokban alkalmazták bizonyos emberi vérből származó B-sejtek halhatatlanná tételére, amelyeket később tenyésztési modellként lehet használni különféle vizsgálatokhoz, beleértve a nagyszabású gyógyszerkönyvi szűrést, vakcina vizsgálat, és nagy áteresztőképességű biológiai vizsgálatok . Többek között a B95-8-ból, egy selyemmajom sejtvonalból előállított EBV tűnik a B-sejt immortalizációjának leggyakoribb és leghatékonyabb EBV forrásának. Az elmúlt évtizedekben a kutatók erőfeszítéseket tettek az immortalizációs módszer és hatékonyságának javítására . Nemrégiben kimutatták, hogy kisebb módosítással az LCLs kis mennyiségű perifériás vérből származhat, akár 0,1 mL is . Ez a megállapítás különösen hasznos olyan körülmények között, amikor a minta térfogata korlátozott.

korábbi vizsgálatok arról számoltak be, hogy az immunsejtek, különösen a B-sejtek és alcsoportjaik kulcsszerepet játszanak az RA patogenezisében . A B-sejtek EBV immortalizációjának sikere ellenére keveset tettek az LCLs jellemzésére és összehasonlítására a szülői B-sejtekkel. Ebben a tanulmányban bebizonyítottuk, hogy az EBV hatékonyan képes halhatatlanná tenni az RA betegek perifériás véréből származó B-sejteket és LCLs-t képezni. Ezután megvizsgáltuk több B-sejt szubpopulációs markerének expressziós szintjét, beleértve a CD23-at és a CD27-et mind az LCLs-ben, mind a szülői B-sejtekben. Ezeket a B-sejtes szubpopulációkat korábban összefüggésbe hozták az RA betegek klinikai megjelenésével. RA-s betegeknél például kimutatták a cd23-at expresszáló emelkedett B-sejteket, amelyeket monoklonális antitestek blokkolhatnak . Hasonlóképpen, a CD27+IgD – memória B-sejtek megnövekedett mennyisége is könnyen kimutatható volt aktív RA-ban szenvedő betegeknél . Másrészt Hu és munkatársai kimutatták, hogy a CD27 + B-sejtek negatívan korreláltak az RA betegség aktivitásával, és a betegeknél károsodást mutattak .

ebben a vizsgálatban arra törekedtünk, hogy értékeljük az RA-betegekből származó Pbmc-k és LCLs B-sejtek cd23 és/vagy CD27 expressziós szintjét. Megvizsgáltuk a CD23 és CD27 expressziós szintjét az LCLs sejtnövekedése szempontjából is.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Betegminták

5 ml perifériás vér tizenhat RA-betegtől (1.Táblázat) A Malajziai Sunway Medical Centerből gyűjtötték a 011/2017/ER etikai jóváhagyási kódex alapján. A pbmc-ket ficoll-Paque (GE Healthcare) módszerrel izoláltuk. Röviden, az EDTA-csőben összegyűjtött vért 1: 1 arányban hígítottuk steril foszfátpufferelt sóoldattal (PBS), majd egy friss centrifugacsőben ficoll-Paque oldatra rétegeztük. A csövet 400 xg-on 40 percig centrifugáltuk szobahőmérsékleten, alacsony gyorsulással és fékezéssel. A felső réteget, amely a plazma, összegyűjtöttük és aliquoted tárolás előtt -80 kb C. A Buffy coat tartalmazó Pbmc-ket gyűjtöttünk 3 ml Pasteur pipettával, és átvisszük egy friss centrifugacsőbe. A sejteket kétszer mostuk PBS-sel, majd 10% magzati szarvasmarha szérumot (FBS) tartalmazó rpmi táptalajjal, majd 10% DMSO-ban fagyasztva tartósítottuk és folyékony nitrogén tároló tartályban tároltuk. 5 ml vért adományoztak egy egészséges önkéntestől kontrollként. A Pbmc-ket és a plazmát a fent leírtak szerint dolgoztuk fel és tároltuk. A diagnózis dátuma, a vérvétel, a PBMCs krioprezerválása és az EBV immortalizációja a kiegészítő anyagokban található (elérhető itt).

2.2. Vérvizsgálat és a betegség aktivitásának kiszámítása

2.3. EBV Immortalizáció

B95-8 selyemmajom eredetű EBV felülúszó volt egy kedves ajándék Dr. Alan Soo-Beng Khoo, molekuláris patológiai egység, Orvosi Kutatóintézet (IMR), Malajzia. A beteg perifériás véréből származó B-sejteket a koncentrált EBV felülúszóval halhatatlanná tettük, amint azt korábban leírtuk . A kiegészítő anyagok táblázata mutatja a pbmc izolálásának és krioprezerválásának dátumát, az LCLs létrehozását, valamint a folyékony nitrogén tároló tartályban tárolt krioprezervált Pbmc-k időtartamát. Röviden, egy korábban krioprezervált PBMC-t tartalmazó injekciós üveget kiolvasztottunk, és meghatároztuk a sejtszámot. A sejteket 2 x 106/mL-re állítottuk be frissen felolvasztott EBV felülúszóval, és egy éjszakán át 37 6CC, 5% CO2-on inkubáltuk egy álló T25 lombikban. Másnap transzformációs közeget (RPMI 1640 + 20% FBS + 200ng/ml ciklosporin) adtunk a lombikba. Az EBV-fertőzött sejteket mikroszkóp alatt figyelték meg, hogy rozettaszerű transzformált LCL-ket keressenek klaszterekben. A 3-6.szakaszokban lévő LCLs-eket az áramlási citometriás elemzéshez és a sejtproliferációs vizsgálathoz használtuk.

2.4. Flow Citometry Analysis

háromszínű citometriát végeztek FACSCalibur flow citométeren (Becton Dickinson) monoklonális antitestek alkalmazásával, amelyek T-sejtek (CD3/PE, SK7 klón), B-sejtek (CD19/BB515, HIB19) és B-sejt alcsoportok (CD23/APC, EBV-CS5 klón és CD27/PE, L128 klón) felületi antigénjeit azonosítják. A sejt életképességének meghatározására 7aad (via-PROBE) oldatot vásároltak a sejt életképességének meghatározásához. Minden antitestet Becton Dickinsontól vásároltak. Röviden, a krioprezervált Pbmc-ket felolvasztottuk és reszuszpendáltuk 50 6L BSA foltpufferben (Becton Dickinson), majd szobahőmérsékleten sötétben inkubáltuk előre hígított fluorokróm konjugált antitestekkel 30 percig. A Pbmc-ket ezután kétszer mostuk BSA foltpufferrel, majd 500 6L BSA pufferben reszuszpendáltuk áramlási citometriás analízis céljából. A kontroll PBMC szuszpenziókat ugyanazzal az eljárással állítottuk elő. 20 000 életképes sejtet, amelyeket a sejt életképességi festékével határoztak meg, kapuztak és gyűjtöttek háromszínű elemzés céljából a CD3/CD19/CD23 és CD19/CD27/CD23 készletekben. Az adatokat CellQuest Pro szoftverrel (Becton Dickinson) elemeztük.

2.5. LCLs proliferációs vizsgálat

az LCLs két kategóriába (gyors és lassú növekedésű) történő elkülönítéséhez a sejtproliferációs sebességet a gyártó utasításait követő RealTime-Glo MT sejt életképességi vizsgálat (Promega) segítségével határoztuk meg. Ez egy nonlytic lumineszcencia alapú vizsgálat, amely képes kimutatni az élő sejtek valós idejű proliferációját a tenyészetben akár 72 órák. Röviden, 10 000 sejtet/kútot vetettünk egy fehér lapos fenekű 96 lyukú lemezre (Greiner Bio-one) három példányban. A mellékelt készletből 2x reakcióelegyet készítettünk, és mindegyik kúthoz hozzáadtuk. A sejteket inkubáltuk 37cc-n, 5% CO2-on 1 órán keresztül, mielőtt a mérést különböző időpontokban végeztük (0, 16, 20, 24, 40, 44, 48, 64, 68, 72 óra) lumineszcencia mikrolemez olvasó (Tecan) használatával. A relatív lumineszcencia egységeket (RLU-k) az idő grafikonjával ábrázoltuk, hogy megmutassuk az LCLs növekedési görbéjét. Ebben a grafikonban a cellaszámot az RLU-k képviselték. Az RLU-k használatával az lcls egyes kategóriáinak megduplázódási idejét (a cellaszám megduplázódásához szükséges időt) egy többpontos online számológép segítségével számítottuk ki, amelyet szignifikancia tesztekhez használtak . Ez az online eszköz a legkisebb négyzetek illeszkedő exponenciális módszert használja a duplázási idő kiszámításához . A növekedési sebességet (az időegységenként előforduló duplázások számát) ezután az alábbi képlet segítségével számítottuk ki:az összes LCLs megduplázódási idejének átlagértéke 54,69 óra volt. Ezért ezt az értéket használták cutoff-ként és LCLs-ként, 54-nél magasabb duplázási idővel.A 69 órát lassan növekvő LCLs-be csoportosítottuk, és fordítva a gyorsan növekvő LCLs-hez.

2.6. Statisztikai elemzés

az áramlási citometriás elemzést három független kísérletben végezték az LCLs minden kategóriájára vonatkozóan, hacsak másként nem határozták meg. Az adatokat átlagos értékekben fejeztük ki szórások (std. dev). A szignifikanciát nem paraméteres tesztekkel (Mann-Whitney és Kruskal-Wallis H) határoztuk meg, ahol az adatok akkor tekinthetők szignifikánsnak, ha p értéke kisebb, mint 0,05.

3. Eredmények és vita

3.1. A vizsgálati alanyok betegségaktivitása

az 1. táblázat a tizenhat RA-beteg és egy egészséges egyén demográfiai adatait, valamint az általánosan használt RA-diagnosztikai markerek vérvizsgálati eredményeit mutatja, amelyek a betegség aktivitását jelzik. A DAS28-CRP index alapján 16 RA beteg közül 3 – at magas betegségaktivitásnak, 8-at mérsékelt aktivitásnak, 3-at remissziónak, a fennmaradó kettőt pedig ismeretlen státusznak minősítettek a hiányos adatgyűjtés miatt.

3.2. LCLs

Pbmc-ket gyűjtöttek a tizenhat RA-betegből és egy egészséges donorból (C-vel jelölve) (1.táblázat), és krioprezerválták. A krioprezervált Pbmc-k alikvotjait ezután EBV-fertőzésre használták. A tizenhét lombikból egy héttel a fertőzés után 15 EBV-transzformált Lclt (kivéve a 4E-t és a 14A-t) hoztak létre, amelyekben a lombikokból látható sejtcsoportokat láttak. Mikroszkóp alatt megjelenítve az LCLs tipikus rozetta morfológiát mutatott, különböző méretekkel, amint azt a piros nyilak jelzik (1.ábra). Az LCLs generáció sikerességi aránya 88,23% volt (15 a 17-ből).

ábra 1

a pbmc-ből származó EBV-immortalizált B-sejtek mikroszkópos vizsgálata RA betegből 8A egy héttel a fertőzés után. Ezeket az immortalizált sejteket LCL-8A-ként jegyezzük fel. a piros nyilak a rozetta-szerű EBV-immortalizált LCL-eket mutatják 4x (felső panel), 10x (középső panel) és 20x (Alsó panel) nagyításoknál. A skála sávok sárga színűek.

3.3. A generált LCLs növekedési rátájának és Megduplázási idejének kiszámítása

ezután meghatároztuk az LCLs minden generált kategóriájának növekedési sebességét egy nem-specifikus és valós idejű lumineszcencia alapú sejtproliferációs vizsgálat segítségével. A 2.ábra az LCLs egyes kategóriáinak növekedési görbéjét mutatja, amelyet a relatív lumineszcencia egységek (RLU-k) képviselnek. A 2. táblázat egy online számológép segítségével mutatja a megfelelő LCLs számított megduplázódási idejét és növekedési ütemét . Az LCLs egyes kategóriáinak kapott megduplázási idejéből az LCLs-t két kategóriába osztjuk az 54 használatával.69 óra (az összes LCLs átlagértéke), mint küszöbérték, ami 10 gyorsan növekvő és 5 lassan növekvő Lclt eredményezett (2.és 4. TÁBLÁZAT) (p<0,05).

ábra 2

az LCLs növekedési görbéi. A relatív lumineszcencia egységek a sejtek életképességi jeleit képviselik különböző időpontokban. A kitöltött vonalak a gyorsan növekvő LCLs-t, míg a szaggatott vonalak a lassan növekvő LCLs-t képviselik.

3.4. Az LCLs

Pbmc-k és a megfelelő LCLs felületi Marker expresszióját áramlási citometriás elemzésnek vetettük alá, hogy meghatározzuk felületi marker expressziójukat, beleértve a CD3, CD19, CD23 és CD27-et. A CD3 és a CD19 a T-sejtek, illetve a B-sejtek felületi markerei. A 8A betegből izolált Pbmc-ket és a megfelelő LCL-8A-t példaként használva a 3.ábra bemutatja, hogy a CD3+ T-sejteket és a CD19+ B-sejteket áramlási citometriával profilozták és kapuzták. Az expressziós szintet ezután százalékban adták meg az elemzett limfociták teljes számából, amely 20 000 sejt volt. A donorok Pbmc-jében 29,78-81,8% volt T-sejt, míg 2,35-45,95% B-sejt volt. Az EBV transzformációt követően a T-sejt populációk 0-0, 27%-ra csökkentek, míg a B-sejt populációk 68, 59-89, 35% – ra növekedtek. Ez egyértelműen jelzi a B-sejt immortalizációjának sikerét az EBV által, amely átvette a T-sejt populációt. A CD3 + T-sejtek elöregedtek, és teljesen lemosódtak az LCLs-ről.

ábra 3

T-sejt (CD3) és B-sejt (CD19) felületi marker profilozás áramlási citometriával. A felső panel a 8a betegtől izolált Pbmc-k elemzését mutatja, míg az alsó panel a megfelelő LCLs (LCL-8a) elemzését mutatja. R1: 7aad-élő sejtek; R2: zárt limfociták; R3: zárt CD3+ T-sejtek; R4: zárt CD19+ B-sejtek.

a CD23 egy B-sejt aktivációs marker, míg a CD27 a memória B-celláinak marker . RA betegeknél a CD23-expresszáló B-sejtek emelkedett szintjéről korábban beszámoltak, hogy pozitív korrelációt mutatnak a betegség aktivitásával, és potenciálisan terápiás célpontként szolgálhatnak . Ezzel szemben a CD27+ B-sejtek negatív korrelációt mutattak a betegség aktivitásával, és RA betegeknél károsodást mutattak . A jelenlegi tanulmányban nem tudtuk megkülönböztetni a CD23 és CD27 expressziós mintázatát a Pbmc-kben és az LCLs-ben (3.táblázat). A 4.ábra a CD19+, CD23+ és CD27+ kapuzását mutatja be a 8a betegtől izolált Pbmc-kből és a megfelelő LCL-8a-ból áramlási citometriával. Az összes Lclből 68,59-89,35% volt CD19 + a várakozásoknak megfelelően CD23 (16,94-58,9%) és CD27 (15,74-80,89%) expressziót mutatnak. A CD23-at és CD27-et együtt expresszáló B-sejtek aránya 5,72-41,53% volt (3.táblázat).

3.5. A betegség aktivitásának korrelációja, a felszíni Marker expressziós szint és az LCL proliferáció

statisztikai elemzést végeztek a betegség aktivitása és a felszíni marker kifejezések közötti korreláció tesztelésére; azonban egyik sem mutatott szignifikanciát. Hasonlóképpen, a betegség aktivitása nem korrelált a megfelelő LCLs növekedési ütemével.

az LCLs egyes kategóriáinak megduplázódási idejéből mind a gyors, mind a lassan növekvő LCLs átlagértékeit meghatározták és statisztikai elemzésnek vetették alá. A 4. táblázat szignifikáns különbséget mutat (p<0.05) A két kategória közötti idő megduplázása szempontjából. Hasonlóképpen meghatároztuk az adott kategória CD23, CD27 és CD23+CD27+ szintjeinek átlagértékeit. A gyorsan növekvő LCLs-ekben nagyobb a CD23 expressziója (42,39%), mint a lassan növekvő LCLs-ben (35,28%). Ez azonban statisztikailag nem szignifikáns (4. táblázat). Fordítva, a CD27 expresszió és a CD23/CD27 koexpresszió alacsonyabb volt a gyorsan növekvő LCLs-ben (36,15 és 13,36%), mint a lassan növekvő LCLs-ben (51,57% és 19,49%). Statisztikai elemzés elvégzésekor csak a gyorsan növekvő LCLs mutat szignifikánsan alacsonyabbat a CD27-ben, de nem CD23/CD27 expresszió. Ezen eredmények validálásához további, nagyobb mintaméretű vizsgálatokra van szükség.

a CD23 magas expressziója az EBV fertőzés vagy átalakulás következménye lehet. Bizonyíték van arra, hogy a B-sejt immortalizációja a sejt CD23 expressziójára támaszkodhat. A tanulmány kimutatta, hogy a CD23-negatív B-sejtek megfertőződhetnek az EBV-vel, de nem halhatatlanná válhatnak, hacsak nem egészítik ki specifikus növekedési faktorokkal . Egy másik tanulmány kimutatta, hogy az EBV-fertőzött B-sejtek két különálló alpopulációvá fejlődhetnek: CD58+IL6 – és CD58+IL6+ . Az előbbi B-sejtes szubpopuláció aktívan szaporodott, míg az utóbbi szubpopuláció megszűnt szaporodni. A CD23 expresszióját az EBV nukleáris antigén 2 (EBNA-2) expresszió is indukálhatja a B-sejtek EBV transzformációját követően, amint azt korábban egy Burkitt lymphoma (BL) sejtvonalban leírtuk . Ezzel szemben a CD27 magasabb expressziója a lassan növekvő LCL-kben arra utalhat, hogy gátló hatásuk van az LCLs proliferációjára.

4. Következtetések

a CD23 stimuláló szerepet játszhat a B-sejtek EBV transzformációjában és az LCLs növekedésében. Tanulmányaink azt mutatták, hogy a gyorsan növekvő LCLs magasabb CD23 expressziót, alacsonyabb CD27 expressziót és CD23CD27 expressziót mutatott. További, nagyobb mintaméretű vizsgálatok indokoltak a felületi marker expresszió EBV-fenntartásra és sejtnövekedésre gyakorolt hatásának alapos vizsgálatára.

adatok rendelkezésre állása

a tanulmány megállapításainak alátámasztására használt adatokat a cikk tartalmazza.

összeférhetetlenség

a szerzők kijelentik, hogy a cikk közzétételével kapcsolatban nincs összeférhetetlenség.

Köszönetnyilvánítás

szeretnénk megköszönni Dr. Alan Soo-Beng Khoo molekuláris patológiai egység, Institute for Medical Research (IMR), Malaysia, az ő nagylelkűsége ellátásában nekünk a B95-8 selyemmajom-eredetű EBV a halhatatlanná munkát. Hooi-Yeen Yap a Sunway Egyetem mesterképzésének címzettje kutatási ösztöndíjjal. Ezt a kutatást a Sunway University Internal Research Grant 2019 (INT-2019-SHMS-DMS-01), A Malaysia National Cancer Council (MAKNA) Cancer Research Award (CRA) 2016 (EXT-SIDS-SIHD-MAKNA-2017-01) és a Sunway Medical Center Research Funds (SRC/002/2017/FR és SRC/003/2017/FR).

kiegészítő anyagok

a táblázat a vizsgált eseteket mutatja a diagnózis dátumával, a vérmintával, a PBMCs krioprezervációjával, az EBV immortalizációjával és a krioprezervált Pbmc-k időtartamával. (Kiegészítő Anyagok)