- Zusammenfassung
- 1. Einleitung
- 2. Materialien und Methoden
- 2.1. Patientenproben
- 2.2. Berechnung von Bluttest und Krankheitsaktivität
- 2.3. EBV Immortalization
- 2.4. Analyse der Durchflusszytometrie
- 2.5. LCL-Proliferationstest
- 2.6. Statistische Analyse
- 3. Ergebnisse und Diskussion
- 3.1. Krankheitsaktivität der Studienteilnehmer
- 3.2. Generation von LCL
- 3.3. Wachstumsrate und Verdopplungszeit Berechnung der generierten LCL
- 3.4. Oberflächenmarkerexpression von LCL
- 3.5. Korrelation der Krankheitsaktivität, des Expressionsniveaus der Oberflächenmarker und der LCL-Proliferation
- 4. Schlussfolgerungen
- Datenverfügbarkeit
- Interessenkonflikte
- Danksagung
- Ergänzende Materialien
Zusammenfassung
Das Epstein-Barr-Virus (EBV) ist einer der häufigsten humanen Herpesvirustypen der Welt. Es ist bekannt, dass EBV mehr als 95% der Erwachsenen auf der Welt infiziert. Das Virus infiziert hauptsächlich B-Lymphozyten und könnte die Zellen in EBV-tragende lymphoblastoide Zelllinien (LCL) immortalisieren und transformieren. Begrenzte Studien konzentrierten sich auf die Charakterisierung der Oberflächenmarkerexpression der immortalisierten LCLs. Diese Studie zeigt die Generierung von 15 LCL von sechzehn Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) und einem gesunden Freiwilligen unter Verwendung von EBV aus B95-8-Marmoset. Die Erfolgsrate der LCL-Erzeugung betrug 88,23%. Alle CD19 + LCL exprimierten CD23 (16,94-58,9%) und CD27 (15,74-80,89%) auf der Zelloberfläche. Unsere Daten zeigten zwei verschiedene Kategorien von LCL (schnell und langsam wachsend) (p < 0,05) basierend auf ihrer Verdopplungszeit. Die langsam wachsenden LCL zeigten einen niedrigeren CD23-Spiegel (35,28%) im Vergleich zu schnell wachsenden LCL (42,39%). Im Gegensatz dazu zeigten die langsam wachsenden LCL einen höheren Prozentsatz sowohl bei CD27 allein als auch bei CD23 + CD27 + in Kombination. Insgesamt können diese Ergebnisse auf die Korrelationen der zellulären CD23- und CD27-Expression mit der Proliferationsrate der erzeugten LCL hindeuten. Eine erhöhte Expression von CD23 kann eine Rolle bei der EBV-Immortalisierung von B-Zellen und dem Wachstum und der Aufrechterhaltung der EBV-transformierten LCL spielen, während die CD27-Expression hemmende Wirkungen auf die LCL-Proliferation haben könnte. Weitere Untersuchungen sind zu diesen Spekulationen gerechtfertigt.
1. Einleitung
Das Epstein-Barr-Virus (EBV) hat weltweit mehr als 95% der Erwachsenen infiziert . EBV zielt hauptsächlich auf B-Zellen ab und infiziert sie, gefolgt von Epithelzellen und in geringerem Maße CD4-T-Zellen . Infektiöse Virionen werden nach der lytischen Replikation in B-Zellen und Epithelzellen produziert. Nach dem lytischen Zyklus folgt die EBV-Latenz und bleibt in den infizierten B-Zellen für den Rest des Lebens des Individuums bestehen . EBV verursacht hauptsächlich infektiöse Mononukleose und ist auch eng mit lymphoiden und epithelialen Malignomen wie Burkitt-Lymphom, Hodgkin-Lymphom, Nasopharynxkarzinom und Magenkrebs assoziiert .
EBV infiziert B-Zellen und könnte die B-Zellen immortalisieren und langfristig wachsende LCL bilden, die die Viren konsistent exprimieren . Diese Methode wurde in Labors verwendet, um bestimmte aus menschlichem Blut stammende B-Zellen zu verewigen, die später als Kulturmodell für verschiedene Studien verwendet werden können, einschließlich groß angelegter Arzneimittelbibliotheksscreenings, Impfstoffstudien und biologischer Studien mit hohem Durchsatz . Unter allen scheint EBV, das aus B95-8, einer Marmoset-Zelllinie, hergestellt wird, die häufigste und wirksamste EBV-Quelle für die B-Zell-Immortalisierung zu sein. In den letzten Jahrzehnten haben sich Forscher bemüht, die Unsterblichkeitsmethode und ihre Effizienz zu verbessern . Kürzlich wurde gezeigt, dass mit einer geringfügigen Modifikation LCLs aus einem kleinen Volumen peripheren Blutes von nur 0,1 ml erzeugt werden können . Dieser Befund ist besonders nützlich unter einem Umstand, in dem das Probenvolumen begrenzt ist.
Frühere Studien haben berichtet, dass Immunzellen, insbesondere B-Zellen und ihre Untergruppen, eine zentrale Rolle bei der Pathogenese der RA spielen . Trotz des Erfolgs der EBV-Immortalisierung von B-Zellen wurde wenig zur Charakterisierung von LCL und zum Vergleich mit den elterlichen B-Zellen unternommen. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass EBV B-Zellen aus dem peripheren Blut von RA-Patienten effizient immortalisieren und LCL bilden kann. Wir untersuchten dann die Expressionsniveaus mehrerer B-Zellen-Subpopulationsmarker, einschließlich CD23 und CD27, sowohl in LCL als auch in ihren elterlichen B-Zellen. Diese B-Zell-Subpopulationen wurden zuvor mit dem klinischen Erscheinungsbild von RA-Patienten in Verbindung gebracht. Beispielsweise wurden bei RA-Patienten erhöhte CD23-exprimierende B-Zellen nachgewiesen, die durch monoklonale Antikörper blockiert werden könnten . In ähnlicher Weise wurde eine erhöhte Menge an CD27 + IgD- Speicher-B-Zellen auch bei Patienten mit aktiver RA leicht nachgewiesen. Auf der anderen Seite zeigten Hu und Mitarbeiter, dass CD27 + B-Zellen negativ mit der Krankheitsaktivität von RA korrelierten und bei den Patienten beeinträchtigt waren .
In dieser Studie haben wir versucht, das Expressionsniveau von CD23 und / oder CD27 von B-Zellen aus den PBMCs und LCL von RA-Patienten zu bewerten. Wir untersuchten auch das Expressionsniveau von CD23 und CD27 in Bezug auf das zelluläre Wachstum von LCL.
2. Materialien und Methoden
2.1. Patientenproben
5 ml peripheres Blut von sechzehn RA-Patienten (Tabelle 1) wurden im Sunway Medical Center, Malaysia, gemäß einem ethischen Zulassungscode von 011/2017 / ER entnommen. PBMCs wurden mit der Ficoll-Paque-Methode (GE Healthcare) isoliert. Kurz wurde das im EDTA-Röhrchen gesammelte Blut 1: 1 mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt und in einem frischen Zentrifugenröhrchen auf Ficoll-Paque-Lösung geschichtet. Das Röhrchen wurde bei 400 xg 40 Minuten bei Raumtemperatur mit geringer Beschleunigung und ‚Abbremsen‘ zentrifugiert. Die oberste Schicht, die das Plasma ist, wurde gesammelt und aliquotiert, bevor sie bei -80 ° C gelagert wurde. Der Buffy Coat, der PBMCs enthielt, wurde mit einer 3mL-Pasteurpipette gesammelt und in ein frisches Zentrifugenröhrchen überführt. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen, gefolgt von RPMI-Medium, das 10% fetales Rinderserum (FBS) enthielt, bevor sie in 10% DMSO kryokonserviert und in einem Flüssigstickstoffspeicher gelagert wurden. 5 ml Blut wurden von einem gesunden Freiwilligen als Kontrolle gespendet. Die PBMCs und das Plasma wurden wie oben beschrieben verarbeitet und gelagert. Das Datum der Diagnose, der Blutentnahme, der PBMCs-Kryokonservierung und der EBV-Immortalisierung sind in ergänzenden Materialien angegeben (verfügbar hier).
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Anti-CCP: antizyklischer citrullinierter Peptid-Antikörper; CRP: C-reaktives Protein; DAS28: disease Activity Score 28; ESR: Blutsenkungsgeschwindigkeit; RF: Rheumafaktor.
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2.2. Berechnung von Bluttest und Krankheitsaktivität
2.3. EBV Immortalization
B95-8 marmoset-derived EBV supernatant war ein freundliches Geschenk von Dr. Alan Soo-Beng Khoo, Abteilung für Molekulare Pathologie, Institut für medizinische Forschung (IMR), Malaysia. B-Zellen aus dem peripheren Blut des Patienten wurden wie zuvor beschrieben mit dem konzentrierten EBV-Überstand immortalisiert. Die Tabelle in den ergänzenden Materialien zeigt das Datum der PBMC-Isolierung und Kryokonservierung, LCL-Einrichtung, und Dauer der im Flüssigstickstoffspeicher gelagerten kryokonservierten PBMCs. Kurz wurde ein Fläschchen mit zuvor kryokonserviertem PBMC aufgetaut und die Zellzahl bestimmt. Die Zellen wurden mit frisch aufgetautem EBV-Überstand auf 2 x 106/ml eingestellt und über Nacht bei 37°C, 5% CO2 in einem stehenden T25-Kolben inkubiert. Am nächsten Tag wurde Transformationsmedium (RPMI 1640 + 20% FBS + 200 ng/ml Cyclosporin) in den Kolben gegeben. Die EBV-infizierten Zellen wurden unter dem Mikroskop beobachtet, um nach rosettenartig transformierten LCL in Clustern zu suchen. LCL in den Passagen 3-6 wurden für die Durchflusszytometrieanalyse und den Zellproliferationstest verwendet.
2.4. Analyse der Durchflusszytometrie
Die Dreifarbenzytometrie wurde am FACSCalibur-Durchflusszytometer (Becton Dickinson) unter Verwendung monoklonaler Antikörper durchgeführt, die Oberflächenantigene für T-Zellen (CD3 / PE, Klon SK7), B-Zellen (CD19 / BB515, HIB19) und B-Zell-Untergruppen (CD23 / APC, Klon EBV-CS5 und CD27 / PE, Klon L128) identifizieren. Cell viability solution 7AAD (VIA-PROBE) wurde gekauft, um die Zelllebensfähigkeit zu bestimmen. Alle Antikörper wurden von Becton Dickinson gekauft. Kurzzeitig wurden kryokonservierte PBMCs aufgetaut und in 50µL BSA-Färbepuffer (Becton Dickinson) resuspendiert und bei Raumtemperatur im Dunkeln mit vorverdünnten Fluorochrom-konjugierten Antikörpern für 30 Minuten inkubiert. Die PBMCs wurden dann zweimal mit BSA-Färbepuffer gewaschen und in 500 µl BSA-Puffer für die Durchflusszytometrieanalyse resuspendiert. Kontroll-PBMC-Suspensionen wurden nach dem gleichen Verfahren hergestellt. 20.000 lebensfähige Zellen, die durch den Zelllebensfähigkeitsfarbstoff bestimmt wurden, wurden gated und für Dreifarbenanalyse an den Sätzen von CD3/CD19/CD23 und CD19/CD27/CD23 gesammelt. Die Daten wurden mit der Software CellQuest Pro (Becton Dickinson) analysiert.
2.5. LCL-Proliferationstest
Um die LCL in zwei Kategorien (schnell und langsam wachsend) zu unterteilen, wurde die Zellproliferationsrate unter Verwendung des RealTime-Glo MT cell Viability Assay (Promega) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Dies ist ein nicht-lytischer lumineszenzbasierter Assay, der die Proliferation lebender Zellen in Kultur in Echtzeit bis zu 72 Stunden nachweisen kann. Kurz gesagt, 10.000 Zellen / Well wurden in dreifacher Ausfertigung auf eine weiße 96-Well-Platte mit flachem Boden (Greiner Bio-one) ausgesät. Aus dem mitgelieferten Kit wurde 2X Reaktionsmischung hergestellt und zu jeder Vertiefung gegeben. Die Zellen wurden bei 37 °C, 5% CO2 für 1 Stunde inkubiert, bevor die Messung zu verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt wurde (0, 16, 20, 24, 40, 44, 48, 64, 68, und 72 Stunden) mit einem Lumineszenz-Mikroplatten-Reader (Tecan). Die relativen Lumineszenzeinheiten (RLUs) gegenüber dem Zeitdiagramm wurden aufgetragen, um die Wachstumskurve der LCLs zu zeigen. In diesem Diagramm wurde die Zellennummer durch die RLUs dargestellt. Unter Verwendung des RLUs wurde die Verdoppelungszeit (Zeit, die erforderlich ist, damit sich eine Zellzahl verdoppelt) jeder Kategorie von LCL unter Verwendung eines Mehrpunkt-Online-Rechners berechnet, die für Signifikanztests verwendet wurden . Dieses Online-Tool verwendet die exponentielle Methode der kleinsten Quadrate, um die Verdoppelungszeit zu berechnen . Die Wachstumsrate (Anzahl der pro Zeiteinheit auftretenden Verdopplungen) wurde dann nach folgender Formel berechnet: Der Mittelwert der Verdopplungszeit aller LCL betrug 54,69 Stunden. Daher wurde dieser Wert als Cutoff und LCLs mit einer Verdopplungszeit von mehr als 54 verwendet.69 Stunden wurden in langsam wachsende LCL und umgekehrt für schnell wachsende LCL gruppiert.
2.6. Statistische Analyse
Die Durchflusszytometrieanalyse wurde in drei unabhängigen Experimenten für jede Kategorie von LCL durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Die Daten wurden in Mittelwerten ausgedrückt Standardabweichungen (Std. dev). Die Signifikanz wurde unter Verwendung nichtparametrischer Tests (Mann-Whitney und Kruskal-Wallis H) bestimmt, bei denen die Daten als signifikant angesehen werden, wenn p kleiner als 0,05 ist.
3. Ergebnisse und Diskussion
3.1. Krankheitsaktivität der Studienteilnehmer
Tabelle 1 zeigt die demografischen Daten der sechzehn RA-Patienten und einer gesunden Person sowie ihre Bluttestergebnisse häufig verwendeter RA-Diagnosemarker, die auf ihre Krankheitsaktivitäten hinweisen. Basierend auf dem DAS28-CRP-Index von 16 RA-Patienten wurden 3 dieser Patienten als hohe Krankheitsaktivität, 8 als moderate Aktivität, 3 als Remission und die verbleibenden zwei als unbekannter Status aufgrund unvollständiger Datenerfassung eingestuft.
3.2. Generation von LCL
PBMCs wurden von den sechzehn RA-Patienten und einem gesunden Spender (markiert als C) geerntet (Tabelle 1) und kryokonserviert. Aliquots von kryokonservierten PBMCs wurden dann für die EBV-Infektion verwendet. Von den siebzehn Flaschen wurden eine Woche nach der Infektion 15 EBV-transformierte LCL (außer 4E und 14A) erzeugt, in denen sichtbare Zellcluster aus den Flaschen zu sehen waren. Bei der Visualisierung unter dem Mikroskop zeigten die LCL eine typische Rosettenmorphologie mit verschiedenen Größen, wie durch die roten Pfeile angezeigt (Abbildung 1). Die Erfolgsquote der LCL-Generation betrug 88,23% (15 von 17).
3.3. Wachstumsrate und Verdopplungszeit Berechnung der generierten LCL
Wir haben dann die Wachstumsrate jeder generierten Kategorie von LCL unter Verwendung eines nicht-lytischen und Echtzeit-Lumineszenz-basierten Zellproliferationstests bestimmt. Abbildung 2 zeigt die Wachstumskurve jeder Kategorie von LCL, dargestellt durch die relativen Lumineszenzeinheiten (RLUs). Tabelle 2 zeigt die berechnete Verdopplungszeit und Wachstumsrate der jeweiligen LCL unter Verwendung eines Online-Rechners . Aus der erhaltenen Verdopplungszeit jeder Kategorie von LCL teilen wir die LCL mit 54 in zwei Kategorien ein.69 Stunden (Mittelwert aller LCL) als Cut-off-Wert, was zu 10 schnell wachsenden und 5 langsam wachsenden LCL führte (Tabellen 2 und 4) (p<0,05).
3.4. Oberflächenmarkerexpression von LCL
PBMCs und entsprechende LCL wurden einer Durchflusszytometrieanalyse unterzogen, um ihre Oberflächenmarkerexpression einschließlich CD3, CD19, CD23 und CD27 zu bestimmen. CD3 und CD19 sind Oberflächenmarker für T-Zellen bzw. Anhand der aus Patient 8A isolierten PBMCs und der entsprechenden LCL-8A als Beispiele zeigt Abbildung 3, wie die CD3 + T-Zellen und CD19 + B-Zellen durch Durchflusszytometrie profiliert und gated wurden. Das Expressionsniveau wurde dann in Prozent von der Gesamtzahl der analysierten Lymphozyten, die 20.000 Zellen waren, dargestellt. In den PBMCs der Spender waren 29,78-81,8% T-Zellen, während 2,35-45,95% B-Zellen umfassten. Nach der EBV-Transformation verringerten sich die T-Zell-Populationen auf 0-0,27%, während die B-Zell-Populationen auf 68, 59-89, 35% zunahmen. Dies zeigt deutlich den Erfolg der B-Zell-Immortalisierung durch EBV, die die T-Zell-Population übernommen hat. CD3+ T-Zellen seneszierten und würden vollständig von den LCL abgewaschen werden.
CD23 ist ein B-Zell-Aktivierungsmarker, während CD27 ein Marker für Gedächtnis-B-Zellen ist . Bei RA-Patienten wurde zuvor berichtet, dass erhöhte Spiegel von CD23-exprimierenden B-Zellen positiv mit der Krankheitsaktivität korrelieren und möglicherweise als therapeutisches Ziel dienen könnten . Im Gegensatz dazu korrelierten CD27 + B-Zellen negativ mit der Krankheitsaktivität und waren bei RA-Patienten beeinträchtigt . In der aktuellen Studie konnten wir das Expressionsmuster von CD23 und CD27 in PBMCs und LCL nicht unterscheiden (Tabelle 3). Abbildung 4 zeigt das Gating von CD19+, CD23 + und CD27+ aus den aus Patient 8A isolierten PBMCs und dem entsprechenden LCL-8A durch Durchflusszytometrie. Während 68,59-89,35% aller LCL erwartungsgemäß CD19 + waren, zeigen sie eine Expression von CD23 (16,94-58,9%) und CD27 (15,74-80,89%). B-Zellen, die CD23 und CD27 koexprimierten, betrugen 5,72-41,53% (Tabelle 3).
3.5. Korrelation der Krankheitsaktivität, des Expressionsniveaus der Oberflächenmarker und der LCL-Proliferation
Es wurde eine statistische Analyse durchgeführt, um die Korrelation zwischen der Krankheitsaktivität und den Expressionen der Oberflächenmarker zu testen. In ähnlicher Weise korrelierte die Krankheitsaktivität nicht mit der Wachstumsrate der entsprechenden LCL.
Aus der Verdopplungszeit jeder Kategorie von LCL wurden Mittelwerte für schnell und langsam wachsende LCL bestimmt und einer statistischen Analyse unterzogen. Tabelle 4 zeigt einen signifikanten Unterschied (p<0.05) in Bezug auf die Verdopplungszeit zwischen den beiden Kategorien. In ähnlicher Weise wurden die Mittelwerte der CD23-, CD27- und CD23 + CD27 + -Spiegel der jeweiligen Kategorie bestimmt. Die schnell wachsenden LCL haben eine höhere Expression von CD23 (42,39%) im Vergleich zu den langsam wachsenden LCL (35,28%). Dies ist jedoch statistisch nicht signifikant (Tabelle 4). Umgekehrt waren die CD27-Expression und die CD23 / CD27-Coexpression in den schnell wachsenden LCL (36,15 bzw. 13,36%) niedriger als in den langsam wachsenden LCL (51,57% bzw. 19,49%). Wenn eine statistische Analyse durchgeführt wird, zeigen nur die schnell wachsenden LCL eine signifikant niedrigere CD27-Expression, nicht jedoch die CD23 / CD27-Expression. Weitere Studien mit größerer Stichprobengröße sind erforderlich, um diese Ergebnisse zu validieren.
Die hohe Expression von CD23 könnte auf die EBV-Infektion oder -Transformation zurückzuführen sein. Es gibt Hinweise darauf, dass die B-Zell-Immortalisierung auf der zellulären CD23-Expression beruhen könnte. Die Studie zeigte, dass CD23-negative B-Zellen durch EBV infiziert werden könnten, aber nicht immortalisiert werden könnten, wenn sie nicht mit spezifischen Wachstumsfaktoren ergänzt würden . Eine weitere Studie zeigte, dass sich EBV-infizierte B-Zellen zu zwei verschiedenen Subpopulationen entwickeln können: CD58+ IL6- und CD58+IL6 + . Die erstere B-Zell-Subpopulation vermehrte sich aktiv, während die letztere Subpopulation aufhörte, sich zu vermehren. Die Expression von CD23 könnte auch durch die Expression von EBV-Kernantigen 2 (EBNA-2) nach der EBV-Transformation von B-Zellen induziert werden, wie zuvor in einer Burkitt-Lymphom (BL) -Zelllinie beschrieben . Im Gegensatz dazu könnte die höhere Expression von CD27 in langsam wachsenden LCL auf ihre hemmende Wirkung auf die Proliferation der LCL hindeuten.
4. Schlussfolgerungen
CD23 könnte eine stimulierende Rolle bei der EBV-Transformation von B-Zellen und dem Wachstum der LCL spielen. Unsere Studien zeigten, dass die schnell wachsenden LCL eine höhere CD23-Expression und eine niedrigere CD27-Expression und CD23CD27-Expression aufwiesen. Weitere Studien mit einer größeren Stichprobengröße sind gerechtfertigt, um die Auswirkungen der Oberflächenmarkerexpression auf die EBV-Aufrechterhaltung und das Zellwachstum eingehend zu untersuchen.
Datenverfügbarkeit
Die Daten, die zur Unterstützung der Ergebnisse dieser Studie verwendet wurden, sind im Artikel enthalten.
Interessenkonflikte
Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bezüglich der Veröffentlichung dieses Artikels bestehen.
Danksagung
Wir möchten Dr. Alan Soo-Beng Khoo von der Molecular Pathology Unit, Institute for Medical Research (IMR), Malaysia, für seine Großzügigkeit danken, uns das von B95-8 marmoset abgeleitete EBV für unsere Unsterblichkeitsarbeit zur Verfügung zu stellen. Hooi-Yeen Yap ist der Empfänger von Sunway University Master-Abschluss durch Forschungsstipendium. Diese Forschung wurde finanziert durch Sunway University Internal Research Grant 2019 (INT-2019-SHMS-DMS-01), National Cancer Council Malaysia (MAKNA) Cancer Research Award (CRA) 2016 (EXT-SIDS-SIHD-MAKNA-2017-01) und Sunway Medical Center Research Funds (SRC/002/2017/ FR und SRC/003/2017/ FR).
Ergänzende Materialien
Die Tabelle zeigt die untersuchten Fälle mit Datum der Diagnose, Blutentnahme, PBMCs-Kryokonservierung, EBV-Immortalisierung und Dauer der kryokonservierten PBMCs. (Ergänzende Materialien)