laadukas sekvensointidata on tärkeä osa sen varmistamista, että tietosi ovat luotettavia ja toistettavissa, ja korkealaatuisen sekvensointidatan saaminen tarkoittaa laadukkaan lähtöaineen käyttämistä. RNA-seq – tiedoissa tämä tarkoittaa sitä, että käytetään RNA: ta, jolla on korkea rin (RNA Integrity Number), 10-pisteasteikolla 1-10, joka antaa tutkijoille standardoidun luvun, joka ilmaisee RNA: n laadun, poistaen prosessista yksilöllisen vinouman ja tulkinnan.
RIN on merkittävä parannus verrattuna tapaan, jolla RNA: n eheys aiemmin laskettiin: 28S-ja 18S-suhde. Koska 28S on noin 5 kb ja 18S on noin 2 kb, ihanteellinen 28S:18S–suhde on 2,7:1-mutta vertailukohtana pidetään noin 2:1. Tämä mittaus perustuu kuitenkin oletukseen, että rRNA: n (erittäin stabiili molekyyli) laatu heijastaa lineaarisesti mRNA: n laatua, joka on itse asiassa paljon vähemmän stabiili ja kokee suuremman vaihtuvuuden .
Kuva 1: RNA-näytteiden RNA-jälkiä, joiden rin-arvot olivat erilaiset. Huomaa ero korkealaatuisten ja heikkolaatuisten näytteiden välillä.
onneksi Agilent Technologies on kehittänyt paremman menetelmän: RIN-arvon. Agilent on kehittänyt hienostuneen algoritmin, joka laskee RIN-arvon, mittaus, joka on huomattava parannus 28S: 18S-suhteeseen. Rin on parannus siinä, että se ottaa huomioon koko RNA-näytteen, ei vain rRNA-mittauksia, kuten näette kuvassa 1
RNA: n eheyden merkitystä määritettäessä geenin ekspression laatua tarkastelivat Chen et al. vuonna 2014 vertailemalla RNA – näytteitä, joissa oli 4 eri rin-lukua (4,5-9,4) ja 3 eri kirjastojen valmistusmenetelmää (poly-a valittu, rRNA-köyhdytetty ja kokonais-RNA) yhteensä 12 näytteelle. Tämän jälkeen he laskivat geeniekspression korrelaatiokertoimen laadukkaimman RNA: n ja huonokuntoisempien näytteiden välillä kirjastojen valmistusmenetelmien välillä.
kuva 2: vain poly-A: n valikoiduilla RNA-kirjastovalmisteilla esiintyy lähtötiedon laadun heikkenemistä RIN-arvon pienenemisen myötä.
kiehtovasti ainoa kirjastojen valmistusmenetelmä, jossa korkean ja heikkolaatuisen RNA: n välinen korrelaatio väheni merkittävästi, oli poly-A: n valittu kirjastojen valmistusmenetelmä. Kahdessa muussa kirjastonvalmistusmenetelmässä korrelaatiokertoimet olivat edelleen yli 0,95 jopa matalilla Kaukaloilla (KS. kuva 2 )!
Chen ym. teorioida, että syy tähän on, että huonontunut näytteitä, jotka ovat poly-valittu johtaa yhä 3 ’ puolueellinen kirjasto valmistelu, ja että siksi menetät arvokkaita lukee tietoja. Koska muut menetelmät eivät sisällä käsittelyä tai rRNA: n poistoa (toisin kuin valinta), kokonaisnäytteessä on huomattavasti vähemmän harhaa.
vaikka näyttää siltä, että vain poly-A: n valikoidulla kirjastojen valmistusmenetelmällä on alhainen RIN-arvo, palveluntarjoajat käyttävät silti mieluummin suhteellisen korkealaatuisia RNA-näytteitä kaikissa kirjastojen valmistusmenetelmissä. Kuitenkin, Jos sinulla on tärkeitä näytteitä, jotka ovat huonompilaatuisia RIN, voi olla syytä keskustella vaihtoehdoista palveluntarjoajan kanssa suoraan–ja me Genohubilla autamme mielellämme helpottamaan keskustelujasi! Ota meihin yhteyttä täällä, jos sinulla on kysyttävää näytteiden sekvensoinnista huonolla RIN: llä.