Molecolare Espressioni di Microscopia Primer: Specializzati Tecniche di Microscopia di Fluorescenza Digital Image Gallery – Rene Canino Madin-Darby Cellule Epiteliali (MDCK)

Derivato da S. H. Madin e N. B. Darby dal tessuto renale di un adulto femmina di cocker spaniel, la linea di cellule MDCK nato nel settembre del 1958. Da quel momento, le cellule sono state ampiamente utilizzate per studiare l’elaborazione della proteina precursore beta-amiloide, nonché l’ordinamento dei suoi prodotti proteolitici.

La morfologia della linea cellulare MDCK è epiteliale e le cellule sono positive per la cheratina mediante colorazione immunoperossidasi. Virus che le cellule MDCK sono suscettibili di includere stomatite vescicolare (ceppo Indiana), vaccinia, coxsackievirus B5, reovirus 2 e 3, adenovirus 4 e 5, esantema vescicolare dei suini e epatite infettiva canina. Le cellule presentano resistenza al coxsackievirus B3 e B4 e al poliovirus 2 e sono negative per la trascrittasi inversa.

La linea MDCK è comunemente utilizzata come modello generale per le cellule epiteliali, che comprendono il tipo di tessuto noto come epitelio. Principalmente trovato che copre gli organi interni e altre superfici del corpo, epitelio è composto da cellule strettamente imballati che sono organizzati in fogli. Queste cellule secernono una matrice extracellulare chiamata lamina basale alla loro base, che aiuta ad ancorare il tessuto epiteliale ai tessuti adiacenti. Anche le cellule epiteliali non hanno accesso diretto ai vasi sanguigni e devono quindi ottenere ossigeno e nutrienti attraverso la diffusione, allo stesso modo in cui sono costrette a liberarsi dei prodotti di scarto metabolici. Funzione epitelia in una varietà di meccanismi, tra cui protezione, assorbimento, ricezione sensoriale e secrezione. Le cellule epiteliali dei reni svolgono un ruolo chiave nella conservazione temporanea e nella successiva secrezione di materiali escretori.

La coltura di cellule renali canine di Madin-Darby presentate nell’immagine digitale sopra è stata etichettata con DAPI e Alexa Fluor 568 coniugati alla falloidina, che mirano rispettivamente al DNA nel nucleo cellulare e alla rete citoscheletrica di F-actina. Inoltre, le cellule sono state trasfettate con un vettore di localizzazione subcellulare del plasmide chimerico pEYFP-Mitocondri (enhanced yellow fluorescent protein). Le immagini sono state registrate in scala di grigi con un sistema di telecamere QImaging Retiga Fast-EXi accoppiato a un microscopio Olympus BX-51 dotato di blocchi ottici con filtro a fluorescenza ad emissione passa banda forniti da Omega Optical. Durante la fase di elaborazione, i singoli canali di immagine sono stati pseudocolorati con valori RGB corrispondenti a ciascuno dei profili spettrali di emissione di fluorofori.

MDCK Cellule Epiteliali con MitoTracker Red CMXRos, Alexa Fluor 488, e DAPI – Un aderente cultura di rene canino Madin-Darby cellule è stato etichettato per l’intracellulare rete mitocondriale e per actina filamentosa con MitoTracker Red CMXRos e Alexa Fluor 488 coniugato con phalloidin, rispettivamente. La sonda ad assorbimento ultravioletto DAPI è stata utilizzata per contrastare il DNA.

Targeting per perossisomi e proteine della clatrina in cellule renali di Madin-Darby con immunofluorescenza – In questa sezione, la coltura descritta di cellule MDCK è stata immunofluorescentemente etichettata con anticorpi monoclonali primari di topo anti-clatrina (catena pesante) seguiti da frammenti di Fab anti-topo di capra coniugati al colorante Cy3 di cianina per colpire la rete citoscheletrica. Inoltre, i perossisomi presenti nella coltura sono stati marcati immunofluorescentemente con Cy2 coniugato ad anticorpi secondari di capra diretti contro anticorpi primari anti-PMP 70 (proteina di membrana perossisomiale 70) di coniglio. I nuclei sono stati contrastati con Hoechst 33342.

Enhanced Yellow Protein Subcellular Localization of Mitochondria in MDCK Cell Cultures – Una coltura di cellule epiteliali del rene canino di Madin-Darby è stata trasfettata con un vettore di localizzazione subcellulare del plasmide chimerico pEYFP-Mitocondria (enhanced yellow fluorescent protein). Le cellule sono state anche colorate con SYTOX Orange e Alexa Fluor 350 coniugate alla falloidina, mirando rispettivamente al DNA e alla rete di actina filamentosa citoscheletrica.

Immunofluorescenza Targeting degli Istoni e Complesso di Golgi nel Rene Canino Colture di Cellule Epiteliali – rene canino Madin-Darby cellule sono state fissate con paraformaldeide, permeabilized, e trattato con una miscela di coniglio (anti-giantin) e mouse (anti-istoni; pan), anticorpi primari, seguita da anticorpi secondari coniugati per Alexa Fluor 488 e Texas Red, rispettivamente. Il cocktail anticorpale secondario conteneva anche Alexa Fluor 350 coniugato alla falloidina, progettato per colpire simultaneamente la rete di actina filamentosa.

Doppia Immunofluorescenza del Complesso del Poro Nucleare di Proteine e di Giunzioni Strette nel Rene Canino Madin-Darby Cellule – cellule Epiteliali giunzioni strette e complesso del poro nucleare proteine contemporaneamente sono stati ripresi in cellule MDCK con un cocktail di mouse anti-NPCP e di coniglio anti-ZO-3 primaria anticorpi, seguita da capra anti-topo e anti-coniglio anticorpi secondari coniugati per Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 568, rispettivamente.

La rete mitocondriale nelle cellule MDCK – Una coltura monostrato aderente di cellule renali canine Madin-Darby è stata immunofluorescentemente etichettata con anticorpi proteici primari anti-oxphos complex V inibitore del topo, seguiti da frammenti Fab anti-topo di capra coniugati alla fluoresceina. La coltura è stata successivamente macchiata con Alexa Fluor 568 coniugato a falloidina per rivelare i dettagli della rete di actina filamentosa e DAPI per il DNA nel nucleo.

Le cellule MDCK con agglutinina – lectine di germe di grano sono una classe specializzata di proteine vegetali che si legano a specifici gruppi di carboidrati attaccati alle proteine o che risiedono nelle membrane cellulari. Un membro di spicco di questo gruppo, l’agglutinina di germe di grano viene spesso utilizzata per localizzare il complesso di Golgi negli esperimenti di etichettatura a fluorescenza. La coltura illustrata in questa sezione è stata etichettata con agglutinina di germe di grano coniugata a Texas Red, così come Alexa Fluor 488 coniugata a falloidina e DAPI (targeting del DNA nel nucleo).

Mirare ai mitocondri con proteine fluorescenti in colture di cellule renali canine – Una coltura semi-confluente di cellule MDCK è stata transitoriamente trasfettata con una chimera plasmidica contenente la sequenza codificante per enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) fusa alla sequenza di targeting mitocondriale dalla subunità VIII della citocromo C ossidasi umana. Dopo la fissazione e la permeabilizzazione, le cellule sono state contrastate per l’actina filamentosa con Alexa Fluor 546 coniugato alla falloidina e per il DNA con il colorante nucleare specifico, DAPI.

Giunzioni strette in colture di cellule renali canine Madin-Darby – La proteina a giunzione stretta ZO-3 è stata visualizzata mediante immunofluorescenza in una coltura confluente di cellule MDCK. Gli anticorpi anti-ZO-3 del coniglio che hanno preso di mira la proteina sono stati etichettati con frammenti Fab secondari capra – anti coniglio coniugati con il colorante cianinico, Cy3. I nuclei sono stati contrastati con il fluoroforo DNA-specifico DAPI.

Colture cellulari aderenti a MDCK con Texas Red, Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 350 – In un esperimento di etichettatura a doppia immunofluorescenza, una coltura di cellule MDCK è stata trattata con un cocktail di anticorpi primari anti-istoni di topo (pan) e anti-PMP 70 di coniglio (proteina di membrana perossisomiale). Le proteine bersaglio sono state successivamente visualizzate con anticorpi secondari anti-topo e anti-coniglio di capra coniugati rispettivamente con Texas Red e Alexa Fluor 488. La rete citoscheletrica di actina filamentosa è stata contrastata con Alexa Fluor 350 coniugato a falloidina.

Schemi di colorazione classici nelle cellule epiteliali del rene canino – La combinazione ormai tradizionale e popolare di MitoTracker Red CMXRos, Alexa Fluor 488 coniugato a falloidina e Hoechst 33342 è stata utilizzata per triplicare una coltura aderente di cellule MDCK. Si noti l’insolita rete di actina filamentosa e il gran numero di mitocondri che circondano i nuclei di queste cellule.

Localizzazione subcellulare dei mitocondri con proteine fluorescenti nelle cellule MDCK – Dopo la fissazione e la permeabilizzazione, la coltura delle cellule MDCK presentate in questa sezione è stata etichettata con ioduro di propidio e Alexa Fluor 350 coniugato alla falloidina, che mirano rispettivamente al DNA e all’actina filamentosa. Inoltre, le cellule sono state prima trasfettate con un vettore di localizzazione subcellulare del plasmide pEYFP-Mitocondria, localizzando così un tag di proteina fluorescente gialla nella rete mitocondriale intracellulare.

L’ampia rete di tubuline nelle cellule epiteliali-microtubuli del rene canino di Madin – Darby è stata macchiata utilizzando l’immunofluorescenza trattando una coltura fissa e permeabilizzata di cellule MDCK con anticorpi primari di topo-anti-alfa-tubulina seguiti da anticorpi anti-topo di capra coniugati con Alexa Fluor 568. I nuclei sono stati contrastati con il verde SYTOX. Anche se non imaged in questa sezione, la cultura è stato anche etichettato con Alexa Fluor 350 coniugato a falloidina.

Visualizzazione simultanea di clatrina, perossisomi e nuclei in colture cellulari MDCK – La coltura di cellule MDCK presentata in questa sezione è stata immunofluorescentemente etichettata con anticorpi monoclonali primari di topo anti-clatrina (catena pesante) seguiti da frammenti di capra anti-topo coniugati con il colorante Cy3 di cianina per colpire la rete citoscheletrica. Inoltre, i perossisomi presenti nella coltura sono stati marcati immunofluorescentemente con Cy2 coniugato ad anticorpi secondari di capra diretti contro anticorpi primari anti-PMP 70 (proteina di membrana perossisomiale 70) del coniglio. I nuclei sono stati contrastati con Hoechst 33342.

La rete di filamenti intermedi di citocheratina nelle cellule epiteliali del rene canino – La citocheratina è un componente comune e abbondante della rete di filamenti intermedi nelle cellule epiteliali. La coltura aderente in questa sezione è stata immunofluorescentemente etichettata con anticorpi primari anti-citocheratina di topo (pan), seguiti da anticorpi secondari anti-topo di capra coniugati a Marina Blue. I mitocondri sono stati visualizzati con MitoTracker rosso CMXRos e i nuclei sono stati colorati con SYTOX verde.

Cellule renali canine Madin-Darby con Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 e Hoechst 33258 – La localizzazione simultanea di giunzioni strette e delle proteine complesse dei pori nucleari (NPCP) è stata eseguita con un doppio esperimento di immunofluorescenza con cellule MDCK utilizzando anticorpi primari anti-NPCP di topo e anti-ZO-3 di coniglio. Gli obiettivi subcellulari sono stati visualizzati utilizzando anticorpi secondari anti-topo e anti-coniglio di capra (IgG) coniugati rispettivamente con Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 568. Il DNA nei nuclei è stato contrastato usando Hoechst 33258.

Etichettatura immunofluorescente della rete mitocondriale in colture cellulari MDCK – Le cellule renali canine di Madin-Darby sono state marcate in modo immunofluorescente con anticorpi primari di proteine inibitori del complesso V anti-oxphos del topo, seguiti da frammenti di Fab anti-topo di capra coniugati alla fluoresceina. La coltura è stata successivamente macchiata con Alexa Fluor 568 coniugato a falloidina per rivelare i dettagli della rete di actina filamentosa e DAPI per il DNA nel nucleo.

MitoTracker Red CMXRos, Cy2 e Hoechst 33258 in cellule renali canine Madin-Darby – Una coltura aderente fissa e permeabilizzata di cellule renali canine Madin-Darby è stata immunofluorescentemente etichettata con anticorpi primari anti-citocheratina del topo, seguita da frammenti di capra anti-topo coniugati con il colorante cianinico, Cy2. Prima della fissazione, la coltura è stata trattata per un’ora con MitoTracker Red CMXRos, e dopo i trattamenti anticorpali, i nuclei sono stati contrastati con Hoechst 33258.

Legame delle lectine al complesso di Golgi nelle colture di cellule epiteliali MDCK – Per visualizzare il legame della lectina al complesso di Golgi nelle cellule MDCK, una coltura aderente è stata trattata con agglutinina di germe di grano coniugata con Oregon Green. Le cellule sono state successivamente counterstained con Alexa Fluor 568 coniugato a falloidina per localizzare la rete di actina filamentosa, e l’acido nucleico macchia DAPI per etichettare il DNA nel nucleo.

Cellule MDCK aderenti con coloranti Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 e Hoechst 33342 – Alexa Fluor sono state impiegate per visualizzare la distribuzione della clatrina e della proteina di membrana perossisomiale 70 (PMP 70) in una coltura di cellule epiteliali del rene canino Madin-Darby. Dopo le reazioni di immunofluorescenza, le cellule sono state contrastate con Hoechst 33342 per rivelare la posizione dei nuclei.

Cellule renali canine Madin-Darby con MitoTracker Red CMXRos, Alexa Fluor 488 e DAPI – Una delle combinazioni di fluorofori più utili per la visualizzazione dei dettagli cellulari interni include MitoTracker Red CMXRos per mirare ai mitocondri, Alexa Fluor 488 coniugato alla falloidina per la rete di actina filamentosa e DAPI per localizzare i nuclei.

Visualizzazione dei Microtubuli e del Citoscheletro di Actina Reti in Colture di Cellule MDCK – per visualizzare contemporaneamente sia l’actina e tubulina reti in cellule MDCK, un fisso e permeabilized cultura è stata trattata con il mouse anti-alfa-tubulina primaria anticorpi, seguita da un cocktail di capra anti-topo anticorpi secondari coniugati per Alexa Fluor 568 mescolati con Alexa Fluor 350 coniugato con phalloidin. I nuclei sono stati contrastati con il verde SYTOX.

Doppia Immunofluorescenza del Complesso del Poro Nucleare di Proteine e di Giunzioni Strette nel Rene Canino Madin-Darby Cellule – cellule Epiteliali giunzioni strette e complesso del poro nucleare proteine contemporaneamente sono stati ripresi in cellule MDCK con un cocktail di mouse anti-NPCP e di coniglio anti-ZO-3 primaria anticorpi, seguita da capra anti-topo e anti-coniglio anticorpi secondari coniugati per Alexa Fluor 568 e Alexa Fluor 488, rispettivamente. I nuclei sono stati contrastati con Hoechst 33258.

Vicinanza del nucleo e del complesso di Golgi in colture cellulari MDCK monostrato – La stretta vicinanza tra il complesso di Golgi e nuclei in cellule renali canine di Madin-Darby è stata sondata in un doppio esperimento di immunofluorescenza con anticorpi primari anti-NPCP (nuclear pore complex protein) del topo e anti-giantin del coniglio (Golgi complex). I bersagli anticorpali sono stati visualizzati con anticorpi secondari di capra coniugati con Alexa Fluor 568 e Alexa Fluor 488, rispettivamente, mentre il quadro citoscheletrico di actina è stato etichettato con Alexa Fluor 350 coniugato con falloidina.