Enhanced Expression of PEPCK mRNA
L’isoforma citosolica di PEPCK è un sito primario di regolazione della gluconeogenesi epatica e renale (71). Tuttavia, questa attività non è regolata da meccanismi allosterici o da modifiche covalenti. Invece, è regolato esclusivamente da meccanismi che determinano il livello dell’mRNA PEPCK e quindi controllano il livello della proteina PEPCK. Ciò è compiuta con i cambiamenti nel tasso di sintesi o nel tasso di degradazione dell’mRNA di PEPCK. Il gene PCK1 che codifica il PEPCK citosolico è composto da 10 esoni e 9 introni ed è di circa 6 kb di lunghezza (13). Codifica un singolo mRNA da 2,6 kb che viene tradotto in una proteina che contiene 621 aminoacidi e ha una massa di 69.300 Da. Il livello di PEPCK mRNA nel rene di ratto aumenta rapidamente dopo l’insorgenza acuta di acidosi (80). L’aumento è iniziato entro 1 ora e raggiunge un massimo entro 7 ore ad un livello che è sei volte maggiore del normale. Gli esperimenti di trascrizione run off (80) hanno indicato che i cambiamenti nel tasso relativo di trascrizione del gene PCK1 rappresentano l’induzione iniziale dell’mRNA PEPCK. Inoltre, i cambiamenti osservati nei livelli di mRNA di PEPCK sono strettamente correlati con i dati precedenti che misuravano i cambiamenti nei tassi relativi di sintesi proteica di PEPCK nei ratti normali e acidotici (84). Tuttavia, il livello sei volte indotto di PEPCK mRNA è sostenuto nei ratti che sono fatti cronicamente acidotici anche se il tasso relativo di trascrizione diminuisce gradualmente e gli altipiani ad un livello che è solo due volte maggiore di quello osservato nei ratti normali (81).
Vari segmenti del promotore PEPCK, così come il promotore principale (da -460 a +73 bp) contenenti mutazioni di blocco specifiche in elementi regolatori sono stati ampiamente analizzati in animali transgenici per determinare il loro ruolo nel controllo dell’espressione genica PCK1 (72). Il promotore del centro di wildtype fuso al gene bovino dell’ormone della crescita (bGH) contiene tutte le informazioni necessarie per assicurare l’espressione appropriata e la regolazione ormonale in fegato. Un segmento più grande 2.3-kb del promotore PEPCK è stato richiesto per guidare l’espressione del transgene nel tessuto adiposo. Tuttavia, entrambi questi costrutti sono stati espressi a bassi livelli nel rene. Al contrario, un transgene CRC362 che contiene solo 362 bp del promotore ma tutti gli esoni e gli introni a valle del gene PCK1 del ratto è stato espresso a livelli normali nel rene (40). Questo transgene differiva dal gene endogeno solo dalla sostituzione di un segmento del gene PCK1 di pollo nella porzione dell’esone finale che codifica il 3′-UTR dell’mRNA PEPCK. Inoltre, quest’ultimo costrutto mostra una significativa induzione renale specifica quando i topi transgenici sono stati resi acidotici (20).
Le cellule LLC-PK1-F + presentano un’induzione sensibile al pH dell’mRNA PEPCK (64). I precedenti tentativi di identificare un elemento sensibile al pH mediante espressione transitoria di vari costrutti reporter PEPCK-cloramfenicolo acetiltransferasi nelle cellule LLC-PK1-F+ hanno prodotto risultati contraddittori (21, 77). Tuttavia, questi studi hanno stabilito chiaramente che il legame di HNF-1 all’elemento P2 è essenziale per l’espressione basale del PEPCK renale e che questa interazione proteina:DNA può contribuire ad aumentare l’espressione durante l’acidosi. I costrutti di luciferasi contenenti 490 o 2300 bp del promotore PEPCK sono fortemente attivati dalla cotrasfezione delle cellule LLC-PK1-F+ con la subunità catalitica della proteina chinasi A (112). Tuttavia, nessuno dei due costrutti mostra un’attività aumentata quando le cellule trasfettate sono state trasferite in mezzo acido (pH 6,9, 10 mm HCO-3) (Wall Q et al., dati non pubblicati, 1999). Questa osservazione e la scoperta che un transgene contenente solo 362 bp del promotore insieme agli esoni e agli introni a valle è sufficiente per ricapitolare l’induzione sensibile al pH (20) suggeriscono che il gene PEPCK può contenere un elemento a valle che è essenziale per l’aumento sensibile al pH nella trascrizione. Altri esperimenti hanno stabilito che C / EBPß (112) e ATF-2 (44) si legano all’elemento CRE-1 del gene PEPCK nel rene.
Studi precedenti hanno anche dimostrato che l’emivita dell’mRNA PEPCK è aumentata nel fegato in risposta a cAMP (76) e glucocorticoidi (132). Una maggiore stabilità può anche contribuire all’induzione prolungata dell’mRNA renale di PEPCK durante l’acidosi cronica (81). Pertanto, la stabilizzazione selettiva dell’mRNA può anche svolgere un ruolo importante nella regolazione fisiologica dell’espressione genica PEPCK. Il sistema promotore reattivo alla tetraciclina è stato utilizzato per quantificare l’emivita di vari MRNA chimerici β-globina-PEPCK (ßG-PCK) nelle cellule LLC-PK1-F+ (67).
L’mRNA ßG-PCK-1, che contiene l’intero 3′-UTR dell’mRNA PEPCK, è stato degradato con un’emivita di 1,2 ore. Il trattamento con RNasi H ha indicato che la deadenilazione rapida si è verificata in concomitanza con la degradazione dell’mRNA ßG-PCK-1. Studi precedenti (108) hanno indicato che PCK-7, un segmento 50-nt all’estremità 3’del 3′-UTR, lega una proteina non identificata che può contribuire al rapido decadimento dell’mRNA PEPCK. Tuttavia, l’mRNA ßG-PCK-7 chimerico ha un’emivita di 17 ore. L’inclusione del segmento PCK-6 adiacente, una regione AU-ricca di 23 bp, ha prodotto l’mRNA ßG-PCK-6/7 che ha un’emivita di 3,6 ore. Il ßG-PCK-3 mRNA che contiene il 3 ‘- metà di 3 ‘ – UTR è stato degradato con la stessa emivita. Sorprendentemente, anche l’mRNA ßG-PCK-2, che contiene l’estremità 5’del 3′-UTR, è stato degradato rapidamente (t1/2 = 5,4 ore). Le analisi del gel-spostamento del RNA hanno stabilito che AUF1 lega ai segmenti PCK-7, PCK-6 e PCK-2 con alta affinità e specificità. L’analisi mutazionale indica che AUF1 si lega a una sequenza UUAU-UUUAU all’interno di PCK-6 e una struttura stem-loop e una regione CU adiacente di PCK-7. Pertanto, AUF1 si lega a più elementi destabilizzanti all’interno del 3’ -UTR che partecipano al rapido turnover dell’mRNA PEPCK. Esperimenti più recenti indicano che il segmento PCK-7 lega anche ζ-cristallina/NADPH: chinone reduttasi con alta affinità e specificità (Hajarnis e Curthoys, dati non pubblicati, 2006). Pertanto, lo stesso meccanismo che spiega l’induzione più graduale degli MRNA GA e GDH può anche contribuire all’aumento prolungato dei livelli di mRNA PEPCK durante l’acidosi cronica.