Epstein-Barr Virus-(EBV-)不死化リンパ芽球様細胞株(Lcl)は高レベルのCD23を発現するが、その成長を支える低CD27を発現する

Abstract

Epstein-Barr virus(EBV)は、世界で一般的なヒトヘルペスウイルス型の1つである。 EBVは、世界の成人の95％以上に感染することが知られています。 このウイルスは主にＢリンパ球に感染し，細胞を不死化し，ＥＢＶ担持リンパ芽球様細胞株（Ｌｃｌｓ）に形質転換することができた。 限られた研究は、不死化されたLCLsの表面マーカー発現を特徴付けることに焦点を当ててきた。 本研究では、15十六関節リウマチ（RA）患者とB95-8マーモセット由来EBVを使用して健康なボランティアからLCLsの生成を示しています。 LCL生成の成功率は88.23％であった。 すべてのCD19+Lclは、細胞表面にCD23(16.94-58.9%)およびCD27(15.74-80.89%)を発現した。 我々のデータは、それらの倍増時間に基づいてLCLsの二つの異なるカテゴリ（速いと遅い成長）（p<0.05）を実証しました。 成長が遅いLCLsは、成長が速いLCLs（42.39％）と比較して低いCD23レベル（35.28％）を示した。 対照的に、成長の遅いLclは、CD27単独およびCD23+CD27+の組み合わせの両方でより高い割合を示した。 全体として、これらの知見は、生成されたLclの増殖速度と細胞CD23およびCD27発現の相関を示唆している可能性がある。 CD23の発現の増加は、B細胞のEBV不死化およびEBV形質転換LCLsの成長および維持において役割を果たし得るが、CD27発現はLCL増殖に対する阻害効果を有 さらなる調査は、これらの推測に保証されています。

1. はじめに

エプスタイン-バーウイルス（EBV）は、世界的に95％以上の成人に感染しています。 EBVは、主にb細胞を標的とし、続いて上皮細胞、およびより少ない程度でCD4T細胞を感染させる。 感染性ビリオンは、B細胞および上皮細胞における溶解複製に続いて産生される。 溶解サイクルの後、EBV潜伏は感染したB細胞に続き、個体の残りの生涯にわたって持続する。 EBVは主に感染性単核球症を引き起こし、Burkittリンパ腫、Hodgkinリンパ腫、鼻咽頭癌、胃癌などのリンパ系および上皮性悪性腫瘍とも密接に関連している。

EBVはB細胞に感染し、B細胞を不死化させ、ウイルスを一貫して発現する長期増殖Lclを形成する可能性がある。 実験室でこの方法が大規模な薬剤の図書館のスクリーニング、ワクチンの調査および高い効率の生物的調査を含むさまざまな調査のために培養モデ とりわけ、マーモセット細胞株であるB95-8から産生されるEBVは、B細胞不死化のための最も一般的で強力なEBV源であると思われる。 過去数十年の間に、研究者は不死化方法とその効率を改善するために努力してきました。 最近、マイナーな修正と、LCLsが0.1mL低い周辺血の小さい容積から発生できることが示されていました。 この知見は、試料体積が制限されている状況下で特に有用である。

これまでの研究では、免疫細胞、特にB細胞とそのサブセットがRAの病因に極めて重要な役割を果たすことが報告されています。 Ｂ細胞のＥＢＶ不死化の成功にもかかわらず、ｌｃｌの特性評価および親Ｂ細胞との比較についてはほとんど行われていない。 本研究では、EBVがRA患者の末梢血からB細胞を効率的に不死化し、Lclを形成できることを実証しました。 我々はその後、LCLSとその親B細胞の両方でCD23とCD27を含むいくつかのB細胞亜集団マーカーの発現レベルを調べた。 これらのB細胞亜集団は、以前にRA患者の臨床的提示と関連していた。 例えば、ＣＤ２ ３を発現する上昇したＢ細胞は、ＲＡ患者において検出されており、それらはモノクローナル抗体によって遮断され得る。 同様に、ＣＤ２ ７＋Ｉｇｄ記憶Ｂ細胞の増加量も、活性Ｒ Ａを有する患者において容易に検出された。 一方、Huと共同研究者は、CD27+B細胞がRAの疾患活性と負の相関を示し、患者で障害されることが判明したことを示した。

本研究では、RA患者由来のPbmcおよびLcl由来のB細胞のCD23および/またはCD27の発現レベルを評価することを試みた。 我々はまた、LCLSの細胞増殖に関してCD23とCD27の発現レベルを調べた。

2. 材料および方法

2.1. 患者サンプル

16人のRA患者からの末梢血の5ml（表1）を、マレーシアのSunway Medical Centreから011/2017/ERの倫理的承認コードの下で収集した。 ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈ Ｅａｌｔｈｃａｒｅ）法を用いて単離した。 簡単に説明すると、ＥＤＴＡ管中で採取した血液を、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１対１に希釈し、新鮮な遠心分離機管中のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ溶液上に層状にした。 チューブを室温で４ ０ ０ｘｇで４ ０分間遠心分離し、低加速および「ブレーキオフ」した。 プラズマである最上層を収集し、-80℃で保存する前にアリコートした。PBMCsを含むバフィーコートを3ml Pasteur pipetteを使用して収集し、新鮮な遠心分離機管に移した。 細胞をＰＢＳで２回洗浄し、続いて１ ０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ培地で洗浄した後、１ ０％ＤＭＳＯ中で凍結保存し、液体窒素貯蔵タンクに保存した。 血液の5mlは、コントロールとして健康なボランティアから寄付されました。 Ｐｂｍｃおよび血漿を上記のように処理および保存した。 診断、採血、PBMCs凍結保存、およびEBV不死化の日付は、補足資料（ここで入手可能）に示されています。

2.2. 血液検査および疾患活性計算

2.3. EBV不死化

B95-8マーモセット由来EBV上清は、マレーシア医学研究研究所（IMR）分子病理ユニット、Alan Soo-Beng Khoo博士からの親切な贈り物でした。 患者の末梢血由来のｂ細胞を、前述のように濃縮されたＥＢＶ上清を用いて不死化した。 補足資料の表は、液体窒素貯蔵タンクに貯蔵されたPBMC単離および凍結保存の日付、LCLs確立、および凍結保存されたPBMCsの期間を示しています。 簡単に言えば、以前に凍結保存されたＰＢＭＣのバイアルを解凍し、細胞数を決定した。 細胞を、新たに解凍したＥＢＶ上清を用いて２×１ ０ ６／ｍＬに調整し、静置Ｔ２ ５フラスコ中で３ ７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。 翌日、形質転換培地（ＲＰＭＩ１ ６ ４ ０＋２ ０％ＦＢＳ＋２ ０ ０ｎｇ／ｍｌシクロスポリン）をフラスコに加えた。 ＥＢＶ感染細胞を顕微鏡下で観察し，クラスター内のロゼット様形質転換Ｌｃｌを探した。 通路3-6のLCLsは、フローサイトメトリー分析と細胞増殖アッセイのために使用されました。

2.4. フローサイトメトリー分析

三色サイトメトリーは、T細胞（CD3/PE、クローンSK7）、B細胞（CD19/BB515、HIB19）、およびB細胞サブセット（CD23/APC、クローンEBV-CS5、およびCD27/PE、クローンL128）の表面抗原を同定するモノクローナル抗体を用いてFACSCaliburフローサイトメーター（Becton Dickinson）上で行われた。 細胞生存率を決定するために、細胞生存率溶液７ＡＡＤ（ＶＩＡ−ＰＲＯＢＥ）を購入した。 全ての抗体はＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから購入した。 簡単に説明すると、凍結保存されたＰｂｍｃを解凍し、５ ０μ ＬのＢＳ ａ染色緩衝液（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中に再懸濁し、予め希釈された蛍光色素抱合抗体と共に暗所で室温で３ ０分間インキュ 次いで、Ｐｂｍｃをｂｓ Ａ染色緩衝液で２回洗浄し、フローサイトメトリー分析のために５ ０ ０μ ＬのＢＳ ａ緩衝液中に再懸濁した。 対照ＰＢＭＣ懸濁液を同じ手順で調製した。 細胞生存性色素によって決定された２ ０，０ ０ ０個の生存細胞をゲート化し、ＣＤ３／ＣＤ１ ９／ＣＤ２ ３およびＣＤ１ ９／ＣＤ２ ７／ＣＤ２ ３のセットで３色分析のために収集した。 データは、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。

2.5. ＬＣＬＳ増殖アッセイ＜５ ７ １ ４＞＜３ ５ ５ ３＞Ｌｃｌｓを２つのカテゴリー（速増殖性および遅増殖性）に分離するために、細胞増殖速度を、製造業者の指示に従って、Ｒｅａｌｔｉｍｅ−Ｇｌｏ Ｍ Ｔ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ） これは72時間まで培養の生きている細胞の実時間拡散を検出できるnonlytic冷光ベースの試金である。 手短に言えば、１ ０，０ ０ ０個の細胞／ウェルを、白色の平底９ ６ウェル板（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−ｏｎｅ）上に三重に播種した。 提供されたキットから２ｘ反応混合物を調製し、各ウェルに添加した。 測定が異なる時点で行われる前に、細胞を37℃、5％CO2で1時間インキュベートした。(0, 16, 20, 24, 40, 44, 48, 64, 68, ルミネッセンスマイクロプレートリーダー（Tecan）を使用して72時間）。 Ｌｃｌｓの成長曲線を示すために、相対発光単位（Ｒｌｕ）対時間グラフをプロットした。 このグラフでは、セル番号はＲｌｕによって表された。 Ｒｌｕを用いて、ｌｃｌｓの各カテゴリーの倍加時間（セル数が値で倍加するのに必要な時間）を、有意性検定に使用された多点オンライン計算機を用いて計算した。 このオンラインツールは、最小二乗近似指数法を使用して倍増時間を計算します。 次いで、成長率（単位時間当たりに生じる倍増の数）を、以下の式を用いて計算した：全てのＬｃｌｓの倍増時間の平均値は５ ４． したがって、この値は、54よりも倍加時間が高いカットオフおよびLCLsとして使用されました。69時間は、成長が遅いLCLsにグループ化され、急速に成長するLCLsのためにその逆も同様であった。

2.6. 統計分析

フローサイトメトリー分析は、特に指定のない限り、LCLsの各カテゴリについて三つの独立した実験で行われました。 データは、平均値標準偏差（ｓｔｄ． デヴ）。 有意性は、ノンパラメトリック検定（Mann-WhitneyおよびKruskal-Wallis H）を使用して決定され、pが0.05未満の場合にデータが有意であると考えられた。

3. 結果と議論

3.1. 研究対象の疾患活動性

表1は、RA患者と健康な個人の人口統計データと、一般的に使用されるRA診断マーカーの血液検査結果を示しています。 16人のRA患者のDAS28-CRP指数に基づいて、これらの患者の3は、高い疾患活性、8は中等度の活性、3は寛解、残りの2つは不完全なデータ収集のために未知の状

3.2. Ｌｃｌの生成＜５ ７ １ ４＞＜３ ５ ５ ３＞Ｐｂｍｃを、１ ６人のＲＡ患者および１人の健康なドナー（Ｃとして標識された）から採取し（表１）、凍結保存した。 その後、凍結保存されたＰｂｍｃのアリコートをＥＢＶ感染に使用した。 セブンティーンフラスコのうち、15EBV変換Lcl（4Eと14Aを除く）は、目に見える細胞クラスターがフラスコから見られた感染後一週間生成されました。 顕微鏡下で可視化すると、LCLsは赤い矢印で示すように、様々なサイズの典型的なロゼット形態を示した（図1）。 LCLs生成の成功率は88.23％（15のうち17）であった。

フィギュア1

感染の一週間後のRA患者8AからのPBMC由来のEBV不死化B細胞の顕微鏡検査。 赤い矢印は、４倍（上部パネル）、１ ０倍（中央パネル）、および２ ０倍（下部パネル）の倍率でロゼット様のＥＢＶ不死化Ｌｃｌを示す。 スケールバーは黄色で示されています。

3.3. 生成されたLCLs

の成長速度と倍加時間の計算我々は、非溶解性およびリアルタイムルミネッセンスベースの細胞増殖アッセイを使用してLCLsの各生成されたカ 図2は、相対発光単位(Rlu)で表されるLclの各カテゴリの成長曲線を示しています。 表2は、オンライン計算機を使用して、それぞれのLCLsの計算された倍増時間と成長率を示しています。 LCLsの各カテゴリの得られた倍加時間から、54を使用してLCLsを二つのカテゴリに分割します。この結果、１ ０個の急成長Ｌｃｌおよび５個の緩成長ｌｃｌが得られた（表２および４）（ｐ＜４ ４ ７ ５＞０．

フィギュア2

LCLsの成長曲線。 相対発光単位は、様々な時点での細胞の生存率信号を表す。 塗りつぶされた線は急速に成長するLclを表し、点線は成長の遅いLclを表します。

3.4. LCLs

PBMCsおよび対応するLCLsの表面マーカー発現は、CD3、CD19、CD23、およびCD27を含むそれらの表面マーカー発現を決定するためにフローサイトメトリー分析に供された。 ＣＤ３およびＣＤ１ ９は、それぞれＴ細胞およびＢ細胞の表面マーカーである。 患者８Ａから単離されたＰｂｍｃおよび対応するＬＣＬ−８Ａを例として使用して、図３は、ＣＤ３＋Ｔ細胞およびＣＤ１ ９＋Ｂ細胞が、フローサイトメトリーによってプロファイ 次いで、発現レベルを、20,000細胞であった分析されたリンパ球の総数からの百分率で提示した。 ドナーのPbmcでは、29.78〜81.8％がT細胞であり、2.35〜45.95％がB細胞であった。 EBV形質転換後、T細胞集団は0〜0.27％に減少し、B細胞集団は68.59〜89.35％に増加した。 これは、Ｔ細胞集団を引き継いだＥＢＶによるＢ細胞不死化の成功を明確に示している。 ＣＤ３＋Ｔ細胞は老化し、Ｌｃｌｓから完全に洗い流されるであろう。

フィギュア3

フローサイトメトリーによるT細胞（CD3）およびB細胞（CD19）表面マーカープロファイリング。 上側のパネルは、患者８Ａから単離されたＰｂｍｃの分析を示し、下側のパネルは、対応するＬｃｌ（ＬＣＬ−８Ａ）の分析を示す。 Ｒ１：７ＡＡＤ−生細胞；Ｒ２：ゲートリンパ球；Ｒ３：ゲートＣＤ３＋Ｔ細胞；Ｒ４：ゲートＣＤ１ ９＋Ｂ細胞。

CD23はB細胞活性化マーカーであり、CD27は記憶B細胞のマーカーである。 RA患者では、CD23発現B細胞のレベルの上昇は、疾患活性と正の相関することが以前に報告されており、それらは潜在的に治療標的として役立つ可能性 対照的に、ＣＤ２ ７＋Ｂ−細胞は、疾患活性と負の相関を示すことが見出され、ＲＡ患者において障害されることが見出された。 現在の研究では、ＰｂｍｃおよびＬｃｌにおけるＣＤ２ ３およびＣＤ２ ７の発現パターンを区別することができなかった（表３）。 図４は、フローサイトメトリーにより、患者８Ａおよび対応するＬＣＬ−８Ａから単離されたＰｂｍｃからのＣＤ１ ９＋、ＣＤ２ ３＋、およびＣＤ２ ７＋のゲーティングを示す。 全てのLclから、予想通り68.59〜89.35%がCD19+であったが、CD23(16.94〜58.9%)およびCD27(15.74〜80.89%)の発現を示した。 CD23およびCD27を共発現するB細胞は5.72〜41.53％であった（表3）。

3.5. 疾患活性、表面マーカー発現レベル、およびLCL増殖の相関

統計的分析は、疾患活性と表面マーカー発現との相関をテストするために行われたが、それらのいずれも有意性を示さなかった。 同様に、疾患活性は、対応するＬｃｌの増殖速度と相関しなかった。

LCLsの各カテゴリの倍加時間から、成長の速いLCLsと成長の遅いLCLsの両方の平均値を決定し、統計分析を行った。 表4に有意差を示す（p<0。05）二つのカテゴリ間の倍加時間の面で。 同様に、それぞれのカテゴリーのＣＤ２ ３、ＣＤ２ ７、およびＣＤ２ ３＋ＣＤ２ ７＋レベルの平均値を決定した。 急成長しているLclは、急成長しているLcl（35.28％）と比較してCD23（42.39％）の高い発現を有する。 しかし、これは統計的に有意ではない（表４）。 逆に、CD27発現およびCD23/CD27共発現は、成長の遅いLcl（それぞれ51.57％および19.49％）と比較して、急速に成長しているLcl（それぞれ36.15および13.36％）で低かった。 統計的分析を実施する場合、急成長しているＬｃｌのみが、ＣＤ２ ７において有意に低いが、ＣＤ２ ３／ＣＤ２ ７発現を示さない。 これらの知見を検証するには、より大きなサンプルサイズのさらなる研究が必要です。

CD23の高発現は、EBV感染または形質転換によるものである可能性がある。 Ｂ細胞不死化が細胞性ＣＤ２ ３発現に依存する可能性があることを示す証拠がある。 この研究では、CD23陰性B細胞はEBVに感染する可能性があるが、特定の成長因子を補充しない限り不死化することはできないことが示された。 別の研究では、EBV感染したB細胞は、CD58+IL6-およびCD58+IL6+の2つの異なる亜集団に発達する可能性があることが示された。 前者のＢ細胞亜集団は積極的に増殖し，後者の亜集団は増殖を停止した。 ＣＤ２ ３の発現はまた、バーキットリンパ腫（Ｂ Ｌ）細胞株において以前に記載されたように、Ｂ細胞のＥＢＶ形質転換後のｅｂｖ核抗原２（ＥＢＮＡ−２）発現によって誘導され得る。 対照的に、成長が遅いLCLsにおけるCD27の高い発現は、LCLsの増殖に対するそれらの阻害効果を示唆している可能性がある。

4. 結論

CD23は、B細胞のEBV形質転換およびLCLsの増殖において刺激的役割を果たす可能性がある。 我々の研究は、急速に成長しているＬｃｌが、より高いＣＤ２ ３発現およびより低いＣＤ２ ７発現およびＣＤ２ ３ＣＤ２ ７発現を示したことを示した。 より大きいサンプルサイズのそれ以上の調査はEBVの維持および細胞成長の表面のマーカーの表現の含意の深さで調査するために保証される。

データの入手可能性

この研究の結果を支持するために使用されたデータは記事内に含まれています。

利益相反

著者らは、この記事の出版に関して利益相反はないと宣言しています。

謝辞

私たちは、私たちの不死化の仕事のためのB95-8マーモセット由来のEBVを私たちに供給することに彼の寛大さのために、マレーシア医学研究所（IMR） Hooi-Yeen Yapは、研究奨学金によるSunway大学の修士号の授与を受けています。 この研究は、Sunway大学内部研究助成金2019（INT-2019-SHMS-DMS-01）、National Cancer Council Malaysia（MAKNA）Cancer Research Award（CRA）2016（EXT-SIDS-SIHD-MAKNA-2017-01）、およびSunway Medical Centre Research Fund（SRC）によって資金提供されました。/002/2017/FRおよびSRC/003/2017/FR）。

補足資料

この表は、診断日、採血、PBMCs凍結保存、EBV不死化、および凍結保存されたPBMCsの期間を持つ研究された症例を示しています。 （補足資料）