Hydrofobisk interaksjonskromatografi (HIC) er en av de mest brukte metodene for å separere og rense proteiner i deres opprinnelige tilstand. HIC viser seg også å være ganske nyttig i å isolere proteinkomplekser og i å studere proteinfolding og utfolding. Så, hvordan HIC arbeid? Hva er prinsippene bak denne teknikken? For å forstå mekanismen bak denne typen kromatografi, er det noen ting du definitivt trenger å vite.
Hvordan FUNGERER HIC?
I et nøtteskall separerer HIC (også kjent som salting ut) proteinmolekyler ved hjelp av egenskapene til hydrofobicitet. I denne metoden blir proteiner som inneholder både hydrofile og hydrofobe områder påført EN hic-kolonne under høye saltbufferforhold.
saltet i bufferen (vanligvis ammoniumsulfat) reduserer solvasjonen av prøveoppløsninger og eksponerer de hydrofobe områdene langs overflaten av proteinmolekylet. Dette letter adsorpsjonen av disse hydrofobe områdene til de hydrofobe områdene på den faste støtten og utfeller (krystalliserer) proteiner ut av løsningen.
Husk at når du utfører denne typen kromatografi, øker tilsetningen av lyotrofiske salter den hydrofobe effekten og reduserer antall og volum av individuelle hydrofobe hulrom mens du reduserer saltkonsentrasjonen, vil det resultere i desorpsjon fra den faste støtten. Som sådan kan prøveluering lettes ved å redusere saltgradienten. Milde organiske modifikatorer eller vaskemidler kan også legges til elueringsbufferen for å hjelpe til med elueringsprosessen.
ved hjelp av prinsippene FOR HIC, kan du binde proteiner fra vandige løsninger i varierende grad avhengig av strukturen av protein av interesse, saltkonsentrasjon, pH, temperatur og organiske løsningsmidler som brukes.
Hydrofob Interaksjon Kromatografi: Avdekke De Underliggende Teorier
det er tre store teorier som kan bidra til å forklare mekanismen bak HIC – (1) salting ut teori, (2) termodynamisk teori og (3) overflatespenning eller Van Der Waals krefter teori.
Salting Ut Teori
Ifølge salting ut teori, hydrofobe aminosyrer danner beskyttet hydrofobe områder ved folding i vandig løsning mens hydrofile aminosyrer tillate proteiner å binde med hydrogenmolekylene i vannet. Som et resultat vil sannsynligheten for at proteinet oppløses i vann øke dersom nok hydrofile områder er tilstede i overflaten av proteinmolekylene.
men ved tilsetning av anti-kaotrofiske salter (som ammoniumsulfat og natriumsulfat) i løsningen, vil noen av vannmolekylene samhandle med saltioner i stedet for den ladede delen av proteinet. Når protein-protein-interaksjonene i løsningen blir sterkere enn løsemiddeloppløsningsinteraksjonene, reagerer proteinmolekylene fritt med hverandre – slik at de kan aggregere og til slutt utfelle ut av løsningen. Derfor reduserer tilsetningen av salt i løsningen oppløseligheten av forskjellige proteiner i varierende grad.
Termodynamikkteori
denne teorien sier at samspillet mellom hydrofobe molekyler er en entropidrevet prosess, basert På Termodynamikkens andre lov. Den hydrofobe interaksjonen mellom to eller flere ikke-polare molekyler i en polar løsningsmiddeloppløsning er en spontan prosess styrt av en endring i entropi. Imidlertid kan slike interaksjoner endres ved å kontrollere temperaturen eller ved å modifisere løsningsmiddelpolariteten.
som sådan, når et ikke-polar molekyl kommer i kontakt med et polart løsningsmiddel som vann, vil det bli en økning i rekkefølgen av løsningsmiddelmolekylene som omgir det hydrofobe molekylet. Så lenge entalpi ikke øker betydelig, vil dette gi en reduksjon i entropi og gi en samlet positiv forandring i Gibbs-energien. Som sådan vil oppløsningen av et ikke-polar molekyl i et polart løsningsmiddel ikke forekomme spontant siden det ikke er termodynamisk gunstig.
men når du setter to eller flere ikke-polare molekyler i et polart miljø, vil de hydrofobe overflatene av makromolekylene bli skjult fra de polare omgivelsene, og de hydrofobe molekylene vil aggregere spontant. De svært strukturerte løsningsmiddelmolekylene som omgir den eksponerte overflaten av de hydrofobe molekylene, vil bli forskjøvet mot hoveddelen av løsningsmidlet som består av mindre strukturerte molekyler. Som en konsekvens øker entropien mens Gibbs-energien minker. Under slike tilfeller blir hydrofob interaksjon en termodynamisk gunstig prosess.
Overflatespenning, Van Der Waals Teori
denne teorien antyder at den hydrofobe interaksjonen I HIC er avhengig av van Der Waals krefter mellom proteiner og immobiliserte ligander siden disse kreftene øker ettersom den bestilte strukturen av vann øker i nærvær av salting ut salter.