sekvenseringsdata av Høy kvalitet er en viktig del av å sikre at dataene dine er pålitelige og replikerbare, og å skaffe sekvenseringsdata av høy kvalitet betyr å bruke utgangsmateriale av høy kvalitet. FOR RNA-seq-data betyr dette å bruke RNA som har et høyt Rin (Rna Integrity Number), en 10-punkts skala fra 1-10 som gir et standardisert tall til forskere som indikerer kvaliteten på DERES RNA, fjerner individuell bias og tolkning fra prosessen.
RIN er en signifikant forbedring i forhold TIL HVORDAN rna-integriteten tidligere ble beregnet: 28s og 18s-forholdet. FORDI 28S er omtrent 5 kb og 18S er omtrent 2 kb, er det ideelle 28s: 18s-forholdet 2,7: 1-men referansen vurderes om 2:1. Imidlertid er denne måling avhengig av antagelsen om at kvaliteten på rRNA (et veldig stabilt molekyl) er lineært reflekterende av mRNA-kvalitet, som faktisk er mye mindre stabil og opplever høyere omsetning .
Figur 1: rna-spor AV rna-prøver med forskjellige rin-verdier. Legg merke til forskjellen mellom høy og lav kvalitet prøver.
Heldigvis Har Agilent Technologies utviklet en bedre metode: RIN-verdien. Agilent har utviklet en sofistikert algoritme som beregner rin-verdien, en måling som er en betydelig forbedring over 28s: 18s-forholdet. RIN er en forbedring ved at den tar hensyn til hele rna-prøven, ikke bare rrna-målingene, som Du kan se I Figur 1
betydningen AV rna-integritet ved å bestemme kvaliteten på genuttrykk ble undersøkt Av Chen et al. i 2014 ved å sammenligne RNA-prøver av 4 FORSKJELLIGE rin-tall (fra 4,5-9,4) og 3 forskjellige biblioteksforberedelsesmetoder (poly-a valgt, rrna-utarmet og totalt RNA) for totalt 12 prøver. De beregnet deretter korrelasjonskoeffisienten av genuttrykk mellom høyeste KVALITET RNA og de mer degraderte prøvene mellom bibliotekets forberedelsesmetoder.
Figur 2: bare poly-a utvalgte rna-bibliotekspreparater opplever en reduksjon i datakvalitet med en reduksjon I rin-verdi.
Fascinerende var den eneste biblioteksforberedelsesmetoden som viste en signifikant reduksjon i korrelasjonen mellom HØY kvalitet og lav kvalitet RNA, poly-a valgt biblioteksforberedelsesmetode. De to andre biblioteksforberedelsesmetodene hadde fortsatt korrelasjonskoeffisienter større enn 0,95 selv ved lave RINs (Se Figur 2)!
Chen et al. teoretisere at årsaken bak dette er at degraderte prøver som er poly-a valgt vil resultere i en stadig mer 3 ‘ partisk bibliotek forberedelse, og at derfor vil du miste verdifulle leser fra dine data. Fordi de andre metodene involverer enten ingen behandling eller rrna fjerning (i motsetning til seleksjon), vil det være betydelig mindre skjevhet i det samlede utvalget.
selv om det virker som om bare poly-a valgt bibliotek forberedelse metoden lider av å ha en lav RIN, leverandører fortsatt foretrekker å arbeide med relativt høy KVALITET RNA prøver for alle bibliotek forberedelse metoder. Men hvis du har viktige prøver SOM er AV lavere KVALITET RIN, kan det være verdt å diskutere alternativene dine med en leverandør direkte-og Vi På Genohub er mer enn glade for å bidra til å lette diskusjonene dine! Ta kontakt med oss her hvis du har ytterligere spørsmål om sekvensering av prøver med dårlig RIN.