wysokiej jakości sekwencjonowanie danych jest ważną częścią zapewnienia, że dane są wiarygodne i powtarzalne, a uzyskanie wysokiej jakości danych sekwencjonowania oznacza użycie wysokiej jakości materiału wyjściowego. W przypadku danych RNA-seq oznacza to użycie RNA o wysokim RIN (RNA Integrity Number), 10 – punktowej skali od 1 do 10, która zapewnia znormalizowaną liczbę badaczom wskazującą jakość ich RNA, usuwając Indywidualne odchylenia i interpretację z procesu.
Rin stanowi znaczną poprawę w stosunku do sposobu, w jaki wcześniej obliczano integralność RNA: stosunek 28S i 18S. Ponieważ 28S to około 5 kb, a 18S to około 2 kb, idealny stosunek 28S:18S wynosi 2,7:1–ale benchmark jest uważany za około 2:1. Jednak pomiar ten opiera się na założeniu, że jakość rRNA (bardzo stabilnej cząsteczki) jest liniowo odzwierciedlająca jakość mRNA, która jest w rzeczywistości znacznie mniej stabilna i doświadcza większych obrotów .
ryc. 1: ślady RNA próbek RNA o różnych wartościach RIN. Zwróć uwagę na różnicę między próbkami wysokiej i niskiej jakości.
na szczęście firma Agilent Technologies opracowała lepszą metodę: wartość RIN. Agilent opracował zaawansowany algorytm, który oblicza wartość RIN, pomiar, który jest znaczną poprawą w stosunku 28S:18S. Rin jest ulepszeniem, ponieważ bierze pod uwagę całą próbkę RNA, a nie tylko pomiary rRNA, jak widać na fig.1
znaczenie integralności RNA w określaniu jakości ekspresji genu zostało zbadane przez Chen i wsp. w 2014 r. porównując próbki RNA o 4 różnych numerach RIN (od 4,5 do 9,4) i 3 różne metody przygotowania biblioteki (wybrany Poli-a, zubożony rRNA i całkowity RNA) dla łącznie 12 próbek. Następnie obliczono współczynnik korelacji ekspresji genów między najwyższej jakości RNA a bardziej zdegradowanymi próbkami między metodami przygotowania biblioteki.
ryc. 2: tylko wybrane preparaty biblioteki RNA Poli-a wykazują spadek jakości danych wraz ze spadkiem wartości RIN.
co fascynujące, jedyną metodą przygotowania biblioteki, która wykazała znaczący spadek korelacji między wysoką jakością a niską jakością RNA, była wybrana metoda przygotowania biblioteki poly-A. Pozostałe dwie metody przygotowania biblioteki nadal miały współczynniki korelacji większe niż 0,95 nawet przy niskich Zanurzeniach (patrz rysunek 2)!
teoretyzuj, że powodem tego jest to, że zdegradowane próbki, które są wybrane Poli-a, spowodują coraz bardziej stronnicze przygotowanie biblioteki 3, a zatem stracisz cenne odczyty z danych. Ponieważ inne metody obejmują albo bez leczenia lub usuwania rRNA (w przeciwieństwie do selekcji), nie będzie znacznie mniej stronniczości w ogólnej próbie.
chociaż wydaje się, że tylko wybrana metoda przygotowania biblioteki Poli-a cierpi na niski RIN, dostawcy nadal wolą pracować ze stosunkowo wysokiej jakości próbkami RNA dla wszystkich metod przygotowania biblioteki. Jeśli jednak masz ważne próbki, które są niższej jakości RIN, może warto nadal dyskutować o swoich opcjach bezpośrednio z dostawcą-a my w Genohub z przyjemnością pomożemy Ci w dyskusji! Skontaktuj się z nami tutaj, jeśli masz dodatkowe pytania dotyczące sekwencjonowania próbek ze słabym RIN.