Monoaminooksydaza-hamowanie i związana z tym aktywność przeciwutleniająca w ekstraktach roślinnych o potencjalnym działaniu przeciwdepresyjnym

Streszczenie

monoaminooksydaza (MAO) katalizuje oksydacyjną deaminację amin i neuroprzekaźników i bierze udział w zaburzeniach nastroju, depresji, stresie oksydacyjnym i niepożądanych reakcjach farmakologicznych. Praca ta bada hamowanie ludzkiego MAO-A przez Hypericum perforatum, Peganum harmala i Lepidium meyenii, które według doniesień poprawiają i wpływają na nastrój i warunki psychiczne. Następnie aktywność przeciwutleniająca związana z hamowaniem MAO jest oznaczana w ekstraktach roślinnych po raz pierwszy. H. perforatum hamowało ludzkie MAO-A, a ekstrakty z kwiatów dawały najwyższe hamowanie (IC50 63,6 µg/mL). Ekstrakty roślinne analizowano za pomocą HPLC-Dad-MS i zawierały pseudohiperycynę, hiperycynę, hiperforynę, adhyperforynę, hiperfirynę i flawonoidy. Hyperforin nie hamował ludzkiego MAO-A, A hiperycyna była słabym inhibitorem tego izoenzymu. Kwercetyna i flawonoidy znacząco przyczyniły się do hamowania MAO-A. P. ekstrakty z nasion harmala silnie hamowały MAO-A (IC50 49,9 µg / l), będąc tysiąc razy silniejszym niż ekstrakty H. perforatum ze względu na zawartość alkaloidów β-karbolinowych (harmaliny i harminy). Ekstrakty z korzenia L. meyenii (maca) nie hamują MAO – A. rośliny te mogą wywierać działanie ochronne związane z działaniem przeciwutleniającym. Wyniki tej pracy pokazują, że ekstrakty P. harmala i H. perforatum wykazują aktywność przeciwutleniającą związaną z hamowaniem MAO (tj. mniejszą produkcją H2O2).

1. Wprowadzenie

enzym monoaminooksydaza (MAO) metabolizuje ksenobiotyczne i endogenne aminy i neuroprzekaźniki, w tym serotoninę, dopaminę, noradrenalinę, tyraminę, tryptaminę i neurotoksynę MPTP . Występuje jako dwa izoenzymy, MAO-A i MAO-B, które odgrywają ważną rolę w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) i narządach obwodowych. MAO-B bierze udział w chorobach neurodegeneracyjnych, a MAO-A w stanach psychicznych i depresji. Inhibitory MAO-B są użyteczne jako neuroprotektanty, podczas gdy inhibitory MAO-A są skutecznymi lekami przeciwdepresyjnymi, chociaż ich stosowanie może wywoływać działania niepożądane (np. przełom nadciśnieniowy w żywności zawierającej tyraminę) . Z drugiej strony utlenianie amin biogennych i neuroprzekaźników przez enzymy MAO wytwarza nadtlenek wodoru (H2O2), rodniki tlenowe i aldehydy, które są czynnikami ryzyka uszkodzenia oksydacyjnego komórek. Dlatego też hamowanie MAO może skutkować ochroną przed stresem oksydacyjnym i neurotoksynami . Ostatnie badania wykazały, że ekstrakty roślinne i spożywcze mogą hamować enzymy MAO, powodując wyżej wymienione efekty biologiczne . Z drugiej strony, w wyniku hamowania MAO, produkty te mogą być zaangażowane w niepożądane interakcje z innymi preparatami ziołowymi, żywnością lub lekami .

Hypericum perforatum L. (rodzina Hypericaceae) (dziurawiec) jest szeroko stosowany w celach zdrowotnych, a ich produkty są dostępne w handlu jako zioła, nutraceutyki, herbaty, nalewki, soki, oleiste Maceraty, fitofarmaceutyki oraz dodatki do żywności i suplementy . H. perforatum jest popularny w leczeniu łagodnej i umiarkowanej depresji . Może powodować niepożądane interakcje farmakologiczne z innymi ziołami, lekami lub pokarmami . Jego zdolność do łagodzenia i poprawy zaburzeń nastroju i depresji przypisuje się związkom aktywnym, które wykazują właściwości przeciwdepresyjne . Najbardziej akceptowanym mechanizmem działania jest hamowanie wychwytu zwrotnego monoaminy, ale mogą być zaangażowane dodatkowe mechanizmy, w tym hamowanie oksydazy monoaminowej i działanie synergiczne . Peganum harmala (Rodzina Zygophyllaceae) i Lepidium meyenii (rodzina Brassicaceae) (maca) są roślinami o działaniu OUN i potencjalnym działaniu przeciwdepresyjnym . P. harmala, pochodzący z regionu Morza Śródziemnego i Azji i rozszerzony na obszary Ameryki Północnej, jest stosowany jako wielofunkcyjny środek leczniczy, w tym zaburzenia OUN. Preparaty tej rośliny mogą wywoływać niekorzystne interakcje farmakologiczne . L. meyenii jest jadalną rośliną z centralnych Andów, której korzenie są używane jako energetyzator żywności i nutraceutyk w celu poprawy warunków fizycznych i psychicznych oraz płodności . Celem tej pracy było zbadanie hamowania ludzkiego MAO – a przez ekstrakty H. perforatum, P. harmala i L. meyenii (maca), a także przez ich aktywne składniki, które zostały zidentyfikowane i przeanalizowane przez HPLC-Dad-MS, a następnie ocena aktywności przeciwutleniającej, która jest szczególnie związana z hamowaniem MAO. Ta specyficzna aktywność przeciwutleniająca jest określana po raz pierwszy w ekstraktach roślinnych.

2. Materiały i metody

rośliny Hypericum perforatum L. zebrane w Ciudad Real (Hiszpania) suszono i rozdzielano na części: kwiaty; górne nadziemne części rośliny, w tym rozgałęzione łodygi i liście, ale bez kwiatów; oraz główne łodygi (centralne i dolne) i korzenie. Zostały one zmielone i proszek używany do przygotowania próbki. Komercyjne zioła i suplementy ziołowe (kapsułki i tabletki) H. perforatum były również kupowane w lokalnych sklepach ziołowych. Rośliny i nasiona Peganum harmala L. zebrano w Toledo (Hiszpania). Lepidium meyenii (maca) zarówno w postaci proszku, jak i komercyjnych tabletek otrzymywano z Peru i lokalnych sklepów. Hypericin standard (>95% purity by HPLC) from HWI Analytik GMBH pharma solutions, hyperforin dicyclohexylammonium salt, quercetin, harmaline, harmine, catalase, clorgyline, 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB), and horseradish peroxidase (HRP) type II were purchased from Sigma-Aldrich.

2.1. Sample Preparation of Plant Extracts

Samples containing H. perforatum (i.e., plant parts, herbal preparation, capsules, or tablets) (500 mg) were homogenized in 10 mL of water/methanol (1 : 1) przy użyciu homogenizatora Ultra Turrax wirowano przy 10000 obr. / min przez 10 min i zebrano supernatant. Proces powtórzono dwukrotnie z pozostałością i trzema frakcjami supernatantu zebranymi, zmieszanymi i przeanalizowanymi za pomocą HPLC, jak wspomniano poniżej. Po trzech kolejnych ekstrakcjach odzyskiwanie hiperycyny i pseudohiperycyny było wyższe niż 97%. Próbki nasion L. meyenii (maca) (500 mg) i P. harmala (500 mg) homogenizowano odpowiednio w 10 mL wody / metanol (1 : 1) lub 10 mL 0,6 M kwasu nadchlorowego: metanol ( 1 : 1) przy użyciu homogenizatora Ultra Turrax wirowano przy 10000 obr. / min przez 10 min i zebrano supernatant. Proces ten powtórzono dwa razy z pozostałością, a zebrane supernatanty zmieszano i przeanalizowano za pomocą HPLC, jak wspomniano poniżej.

2.2. RP-HPLC Analiza ekstraktów roślinnych

analizę ekstraktów z H. perforatum przeprowadzono metodą RP-HPLC z matrycą diod UV i detekcją fluorescencji przy użyciu HPLC 1050 (Agilent) w połączeniu z detektorem 1100 Diode array (Dad) (Agilent) i detektorem fluorescencji 1046a. A 150 3,9 mm, 4 µm, do separacji użyto kolumny Nova-pak C18 (wody). Warunki chromatograficzne to 50 mM bufor fosforanu amonu (pH 3) (bufor A) i 20% a w acetonitrylu (bufor B). Gradient zaprogramowano od 0% (100% A) do 32% B w 8 min i 100% B w 10 min. Natężenie przepływu wynosiło 1 mL / min, temperatura kolumny wynosiła 40°C, a objętość wtrysku 20 µL. Detekcję hiperycyny przeprowadzono przez absorbancję przy 590 nm i fluorescencję przy 236 nm dla wzbudzenia i 592 nm dla emisji. Stężenie hiperycyny oznaczano na podstawie krzywej kalibracyjnej odpowiedzi (absorbancja przy 590 nm) w porównaniu ze stężeniem roztworami otrzymanymi w laboratorium ze wzorca hiperycyny. Ten sam czynnik odpowiedzi zastosowano do pseudohiperycyny, protohiperycyny i protopseudohiperycyny. Flawonoidy i glikozydy flawonoidowe analizowano przy 265 nm i 355 nm, a stężenie kwercetyny oznaczano przy 355 nm z krzywej kalibracji odpowiedzi w stosunku do stężenia. Frakcję HPLC odpowiadającą flawonoidom i glikozydom flawonoidowym (7 do 11 min) zebrano przez kolejne zastrzyki ekstraktu H. perforatum (zioła) i, po odparowaniu w próżni, rozpuszczono w 30% metanolu i zastosowano do hamowania MAO-A. Flloroglukinole (hyperforin, adhyperforin, hyperfirin i adhyperfirin) analizowano przy 280 nm przy użyciu tej samej kolumny (Nova-pak C18) i w warunkach, ale pod elucją izokratyczną z 20% buforu fosforanu amonu 50 mM, PH 3 i 80% acetonitrylu. Stężenie tych związków oznaczono na podstawie krzywej kalibracyjnej wzorca hyperforin. Analizę alkaloidów β-karbolinowych u P. harmala i L. meyenii przeprowadzono zgodnie z wcześniejszymi opisami .

2.3. Identyfikacja za pomocą spektrometrii mas HPLC-ESI

identyfikacja związków w ekstraktach H. perforatum została przeprowadzona za pomocą HPLC-MS (electrospray-negative ion mode) przy użyciu serii 1200 HPLC-DAD sprzężonej z 6110 quadrupole-MS (Agilent). Separację chromatograficzną przeprowadzono na 150 kolumnach 2,1 mm i.D. zorbax SB-C18 (5 µm) (Agilent Technologies). Warunki chromatograficzne były eluent a: kwas mrówkowy (0,1%); B: kwas mrówkowy (0,1%) w acetonitrylu; gradient: 0% do 70% B w 8 min i 100% B w 10 min, natężenie przepływu: 0,3 mL/min; : 40°C; Zakres masy: 50-700 u i napięcie stożka: 150 V. do identyfikacji floroglucynoli (np. hyperforin), separację przeprowadzono przy użyciu Nova-pak C18 (4 µm) kolumna z tymi samymi Eluentami i elucją izokratyczną (eluent a, 20% i eluent B, 80%) przy natężeniu przepływu 0,7 ml/min i widmach masowych rejestrowanych w jonizacji ujemnej i dodatniej. Identyfikacji związków dokonano na podstawie widm masowych, widm UV-vis (DAD) pików chromatograficznych oraz koelucji wzorcami. β-karboliny u P. harmala i L. meyenii zostały zidentyfikowane jako wcześniej opisane .

2.4. Testy hamowania monoaminooksydazy (MAO-A)

testy MAO przeprowadzono jak gdzie indziej . Krótko mówiąc, frakcje białek błonowych zawierające MAO-A (BD-Gentest) rozcieńczono do pożądanego stężenia w buforze fosforanowo-potasowym 100 mM (pH 7,4). 0, 2 mL mieszaniny reakcyjnej zawierającej 0, 01 mg/mL białka i 0.25 mM kynuraminę w 100 mM fosforanie potasu (pH 7,4) inkubowano w temperaturze 37 ° C przez 40 minut. Po inkubacji reakcję zatrzymano przez dodanie 2 N NaOH (75 µL), następnie dodano 70% HClO4 (25 µL), a próbkę odwirowano (10000) przez 10 minut. Supernatant (20 µL) wstrzyknięto do HPLC i produkt deaminacji kynuraminy (tj. 4-hydroksychinoliny) powstałej podczas reakcji enzymatycznej, oznaczonej detekcją macierzy diod RP-HPLC przy 320 nm. W celu obliczenia stężenia 4-hydroksychinoliny skonstruowano krzywą odpowiedzi pola względem stężenia. W celu przeprowadzenia testów hamowania MAO, porcje ekstraktów z roślin lub preparatów handlowych lub zamiast nich czystych związków wygodnie rozcieńczano i dodawano do mieszanin reakcyjnych zawierających kynuraminę (0,25 mM) i Mao-a (0,01 mg/mL białka) w buforze fosforanowo-potasowym 100 mM (pH 7,4), z reakcją enzymatyczną i analizą przeprowadzoną jak wyżej, i porównywano z odpowiednimi kontrolami zawierającymi rozpuszczalnik. Jako pozytywną kontrolę hamowania zastosowano standardowy inhibitor klorgylinę (>90% hamowania przy 2,5 µM). Inkubacje przeprowadzono co najmniej w dwóch egzemplarzach z różnych eksperymentów, a wartości IC50 obliczono przy użyciu GraphPad Prism 4.0.

2.5. Oznaczanie aktywności przeciwutleniającej związanej z hamowaniem monoaminooksydazy (MAO)

testy (0,2 mL) mieszanin reakcyjnych w buforze fosforanowo-potasowym 70 mM (pH 7,4), zawierającym 0,025 mg/mL białka MAO-a i 0,25 mM kynuraminy, inkubowano w temperaturze 37°C przez 40 minut w nieobecności (testy kontrolne) lub w obecności ekstraktów roślinnych. Testy MAO przeprowadzono również w obecności klorgyliny (25 µM), klasycznego inhibitora MAO-a (pozytywna Kontrola hamowania) lub enzymu katalazy (100 µg/mL). Po okresie inkubacji mieszaninę reakcyjną dodano węglem aktywowanym (3,5 mg), zmieszano i przesączono (0,45 µm). Roztwór dodano 20 µL 10 mM tetrametylobenzydyny (TMB) w 40% DMSO i 20 µL peroksydazy chrzanowej (HRP) typu II (1 mg/mL), trzymano przez 5 minut i dodano 0,3 mL 0,5 m roztworu H2SO4. Absorbancję przy 450 nm mierzono w celu określenia diiminy TMB, żółtego produktu powstałego w wyniku utleniania TMB przez HRP i H2O2 wytworzonego w deaminacji oksydacyjnej katalizowanej przez MAO. Utlenianie TMB w obecności inhibitorów MAO porównano z odpowiednimi grupami kontrolnymi bez inhibitorów, a odpowiednie ślepe próby wykazały brak zakłóceń.

3. Wyniki i dyskusja

Preparaty handlowe H. perforatum hamowały ludzkie MAO-a o podobnej sile działania: wartości IC50 142,3 ± 30.6 µg/mL (preparat ziołowy), 193 ± 61 µg/mL (kapsułki) i 173 ± 29 µg/mL (tabletki) (ryc. 1(A)). Jeśli chodzi o rośliny, ekstrakty H. perforatum z kwiatów dały najwyższe zahamowanie (IC50 63,6 ± 9,4 µg/mL), a następnie łodygi i liście nadziemne (IC50 143,6 ± 16,5 µg/mL), a najniższe w ekstraktach korzeniowych (Fig. 1(b)). Ekstrakty z nadziemnych części H. perforatum analizowano metodą HPLC-DAD-ESI (electrospray-negative jonization). Wykazały one obecność dwóch głównych naftodiantronów zidentyfikowanych jako pseudohiperycyna i hiperycyna(ryc. 2 (A) I Tabela 1). Ekstrakty kwiatowe miały dwa dodatkowe związki zidentyfikowane jako protopseudohiperycyna i protohiperycyna. Fenoli i flawonoidów obfitujących w ekstrakty H. perforatum (ryc. 2 (b)). Kwas chlorogenowy i glikozydy kwercetyny rutyna, hiperozyd, izoquercytryna, miquelianina, hiperozyd acetylowy i kwercytryna, a także wolna kwercetyna i biapigenina, zostały zidentyfikowane przez HPLC-DAD (jonizacja ujemna ESI) I DAD (Tabela 1). Z drugiej strony, ekstrakty kwiatowe zawierały cztery floroglukinole (fig. 2 (c)), które zostały zidentyfikowane przez HPLC-DAD-MS (jonizacja ESI ujemna i dodatnia) i DAD jako hyperforin, adhyperforin, hyperfirin i adhyperfirin (Tabela 1). Obecność tych związków (Fig. 3) w roślinie zgadza się z innymi wynikami . Zawartość głównych składników oznaczono metodą HPLC (Tabela 2). Stężenie pseudohiperycyny było wyższe niż hiperycyna, podczas gdy protopseudohiperycyna i protohiperycyna były związkami mniejszymi (0,4 µg/mg protopseudohiperycyny i 0.17 µg/mg protohiperycyny wykryto w kwiatach). W roślinie największą zawartość hiperycyny stwierdzono w kwiatach, przy czym znacznie niski poziom wykryto w łodygach i brak w korzeniach. Hyperforin był bardzo bogaty w kwiaty (27,2 µg / mg), podczas gdy stężenie w preparatach komercyjnych wynosiło od 0,36 do 2,4 µg/mg. W kwiatach pojawiła się również adhyperforina (1,4 ± 0,07 µg/mg), hyperfiryna (4,2 ± 0,02 µg/mg) i adhyperfiryna (0,46 ± 0,02 µg/mg). Flawonoidy obfitują w H. perforatum i większość z nich to glikozydy kwercetyny (fig. 2 (b)), których obecność była znacznie większa w kwiatach niż w innych częściach rośliny. Zawartość wolnej kwercetyny w kwiatach wynosiła 2,0 µg/mg, natomiast w preparatach komercyjnych oznaczono zawartość 6,7 µg/mg.

(a)

(b)

(a)
(b)

1

hamowanie ludzkiej oksydazy monoaminowej – a (MAO-A) przez ekstrakty preparatów handlowych H. perforatum (a) (kapsułki, ■; tabletki, ■ ; zioła,▼) i ekstrakty z różnych części rośliny (B) (kwiaty,∆; łodygi górne,◊; łodygi główne (Centralne),×; korzenie,○). Znaczące różnice () między ekstraktami w wybranym stężeniu są oznaczone różnymi literami.

(a) nm

(b) nm

(c) nm

(a) nm
(b) nm
(c) nm

Figure 2

HPLC chromatograms of extracts from H. perforatum flowers. (a) Detection of hypericins at 590 nm. 1: protopseudohypericin; 2: pseudohypericin; 3: protohypericin; and 4: hypericin. (b) Detection of phenols and flavonoids at 265 nm. 1: chlorogenic acid; 2: rutin; 3: hyperoside; 4: izoquercytryna; 5: miquelianina; 6: hiperozyd acetylowy; 7: kwercytryna; 8: kwercetyna; i 9: biapigenina. C) wykrywanie floroglukinoli przy 280 nm. 1: hyperfirin, 2: adhyperfirin; 3: hyperforin; i 4: adhyperforin.

3

struktury związków zidentyfikowanych w H. perforatum: hiperycyny, kwercetyny i flawonoidy kwercetyny oraz flloroglucynole (hyperforina, adhyperforina, hyperfiryna i adhyperfiryna).

hamowanie MAO-a przez H. ekstrakty z perforatum wskazują na występowanie inhibitorów. Hiperycyna, hyperforina i flawonoidy mogą przyczyniać się do tego hamowania i zostały ocenione jako inhibitory (rycina 4). Hiperycyna hamuje MAO-A (IC50 35,5 ± 2,1 µM lub 17,9 µg/mL) (Fig.4 (A)). Z stężenia w tabeli 2 wynika, że hiperycyna jest słabym czynnikiem hamującym MAO w ekstraktach z H. perforatum. Rzeczywiście, obliczona zawartość hiperycyny przy wartości IC50 w testach ekstraktu z kwiatów (tj. 63,6 µg/mL) wynosiła 0,1 µg/mL, co jest niskie w porównaniu z IC50 hiperycyny (17,9 µg/mL). Hyperforin nie hamował działania MAO – A(rycina 4 (b)). Kwercetyna hamowała ludzki MAO-a(fig. 4 (b)) o wartości IC50 11,1 ± 0,8 µM (tj. 3,36 µg/mL). Następnie kwercetyna była lepszym inhibitorem niż hiperycyna, chociaż jej moc była nadal niska, aby wyjaśnić całe hamowanie ekstraktów. Tak więc obliczona zawartość kwercetyny w IC50 w testach ekstraktu kwiatowego wynosiła 0,13 µg/mL, co jest niższe niż IC50 kwercetyny (3,4 µg / mL). Gdy frakcja odpowiadająca glikozydom kwercetyny i flawonoidom(7-11 min, fig.2 (b)) została zebrana przez RP-HPLC, hamowała ona MAO-a (90% inhibicja przy ekstrakcie 700 µg/mL), co wskazuje na udział tych związków w hamowaniu MAO w H. perforatum, prawdopodobnie przez działanie addytywne. Następnie hamowanie MAO-A może wynikać ze składników, takich jak kwercetyna i pokrewne flawonoidy (tj. glikozydy kwercetyny), które są obfite w roślinie. Ponadto mniejsze związki nie zidentyfikowane tutaj mogą również przyczyniać się do hamowania MAO, ponieważ główne związki w tabeli 2 nie wyjaśniają całkowitego hamowania.

(a)

(b)

(a)
(b)

ryc. 4

hamowanie ludzkiej oksydazy monoaminowej-a (MAO-A) przez aktywne składniki H. perforatum: hiperycynę (a) i kwercetynę (■) i hyperforynę (▲) (b).

ekstrakty z nasion P. harmala silnie hamują ludzkie MAO-a(fig. 5 (A)) dające wartość IC50 49,9 ± 5,6 µg/L. Analiza chromatograficzna wykazała, że hamowanie było spowodowane obecnością alkaloidów β-karbolinowych, harmaliny i harminy, które zidentyfikowano za pomocą HPLC-Dad-MS (Fig. 5 (c)). Zawartość tych alkaloidów oznaczona w nasionach wynosiła 48,5 mg / g dla harmaliny i 40,0 mg/g dla harminy (oznacza to 2,4 ng/mL i 2,0 ng/mL, resp., do testów w IC50). Dlatego siła hamowania MAO-a przez nasiona P. harmala była 1274 razy silniejsza niż w przypadku kwiatów H. perforatum. Jak pokazano na fig. 5(b), ekstrakty z korzenia Lepidium meyenii nie hamowały ludzkiego MAO-A. L. meyenii (maca) jest popularną rośliną z Andów, której korzenie są coraz częściej wykorzystywane ze względu na swoje właściwości odżywcze i lecznicze, jak energetyzujące i poprawiające nastrój i sprawność seksualną . Wcześniejsze doniesienia wskazywały, że zawierają one alkaloidy, w tym β-karboliny, które mogą hamować MAO. Analiza ekstraktów na alkaloidy β-karbolinowe dała 25 µg/g (proszek maca) i 11,7 µg/g (kapsułki) kwasu 1-metylo-1,2,3,4-tetrahydro-β-karbolino-3-karboksylowego jako główny związek. Ta swoista β-karbolina nie jest inhibitorem MAO-A.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

5

hamowanie ludzkiej oksydazy monoaminowej – a (MAO-A)przez ekstrakty z nasion P. harmala (a) i korzenia L. meyenii (maca) (B) (kapsułki, ▼ i proszek,■). C) chromatogram HPLC ekstraktu z nasion P. harmala, który silnie hamował wykrywanie absorbancji ludzkiej MAO-a przy 254 nm. Zidentyfikowane związki to harmalina (m/z Przy 215 (m + h)+, przy 375 nm) i harmina (m/z Przy 213 (m + h)+, przy 245 i 322 nm).

MAO wytwarza nadtlenek wodoru (H2O2), który bierze udział w uszkodzeniach komórek oksydacyjnych i stanach patologicznych . Następnie hamowanie MAO może prowadzić do specyficznych działań przeciwutleniających . W celu zbadania aktywności przeciwutleniającej związanej z hamowaniem MAO, w badaniach tych opracowano eksperymenty, które łączyły aktywność MAO-A z utlenianiem tetrametylobenzydyny (TMB) przez peroksydazę chrzanową (HRP) i H2O2 wytwarzanym podczas deaminacji oksydacyjnej katalizowanej przez MAO (Fig.6). Ekstrakty H. perforatum i P. harmala, które hamowały MAO – a, jak pokazano powyżej, znacznie zmniejszały utlenianie TMB. Natomiast ekstrakty z korzenia L. meyenii (maca), które nie hamowały MAO, miały niską aktywność przeciwutleniającą w tym teście. Klorgylina, która jest silnym inhibitorem MAO-a, znacznie zmniejszała utlenianie TMB, gdy była stosowana jako kontrola. To samo stało się z obecnością katalazy w pożywce, która usuwa H2O2 generowane przez MAO-A. Dlatego wyniki te wskazują, że ekstrakty H. perforatum i P. harmala dały specyficzne działanie przeciwutleniające związane z niższą produkcją H2O2 przez hamowanie MAO.

6

aktywność przeciwutleniająca związana z hamowaniem MAO w testach aktywności sprzęgającej MAO-A z późniejszym utlenianiem tetrametylobenzydyny (TMB) w obecności H2O2 wytworzonego w reakcji MAO i peroksydazy chrzanowej (HRP). Wykres przedstawia utlenianie TMB do diiminy (absorbancja przy 450 nm) w testach kontrolnych (100%) oraz w obecności H. perforatum (ekstrakty ziół i kwiatów, 800 µg/mL), ekstraktów z nasion P. harmala (0,8 µg / mL), L. ekstrakty z korzenia meyenii (maca) (800 µg/mL), klorgylina (standardowy inhibitor MAO-A) (25 µM) i katalaza (100 µg / mL). różnice () w stosunku do kontrolek.

H. perforatum poprawia zaburzenia nastroju i depresję . Jak pokazano tutaj, zawiera związki takie jak hyperforin, hypericyny i flawonoidy odpowiedzialne za działanie przeciwdepresyjne (ryc. Jednak specyficzny mechanizm działania przeciwdepresyjnego nie jest całkowicie poznany. Najbardziej akceptowanym mechanizmem jest hamowanie wychwytu zwrotnego monoaminy . Jednak niektóre badania sugerują połączenie mechanizmów i efektów synergicznych . P. harmala wykazuje liczne działania biologiczne i farmakologiczne. Ich nasiona są coraz częściej wykorzystywane do celów rekreacyjnych ze względu na ich działanie psychoaktywne i neuroaktywne . Hamowanie ludzkiego MAO-A jest ustalonym mechanizmem działania przeciwdepresyjnego . Zarówno nieodwracalne, jak i odwracalne inhibitory MAO-A (np. fenelzyna i moklobemid) są z powodzeniem stosowane jako leki przeciwdepresyjne. W tym badaniu ekstrakty H. perforatum hamowały ludzkie MAO-A. Jednak hamowanie to było umiarkowane. Był ponad tysiąc razy niższy niż ekstrakty nasion P. harmala. Sacher et al. donoszą, że obłożenie miejsc MAO-A w ludzkim mózgu określone przez obrazowanie PET z wiązaniem 11C-harminy (tj. ta sama β-karbolina odpowiedzialna za hamowanie MAO w P. harmala) było wysokie dla odwracalnego inhibitora MAO, takiego jak moklobemid, ale niskie dla ekstraktu H. perforatum (dziurawca zwyczajnego) . Oznacza to, że inhibitory MAO-a w H. perforatum nie wiążą się skutecznie z aktywnymi miejscami MAO-a w mózgu w przeciwieństwie do harminy β-karboliny. Inhibitory MAO-a w H. perforatum to flawonoidy, takie jak kwercetyna i ich glikozydy, a poziomy tych związków, które docierają do mózgu, mogą nie wystarczyć, aby zająć miejsca MAO-A w mózgu i hamować enzym . Natomiast inhibitorami P. harmala są alkaloidy β-karbolinowe, w tym harmina i harmalina, które mają bardzo dobrą penetrację mózgu, wiążą się z wysokim powinowactwem do miejsc MAO i wykazują działanie przeciwdepresyjne . Dlatego P. harmala mógł sobie pozwolić na działanie przeciwdepresyjne poprzez hamowanie MAO. W związku z tym interesujące może być zbadanie działania przeciwdepresyjnego H. perforatum i P. harmala samodzielnie i w połączeniu, ponieważ mają różne mechanizmy działania.

hamowanie MAO-a przez ekstrakty H. perforatum i P. harmala może przyczyniać się do innych efektów biologicznych tych roślin, takich jak działanie przeciwutleniające i niepożądane reakcje farmakologiczne. Ekstrakty z tych roślin wywierają działanie neuroprotekcyjne i przeciwzapalne związane z aktywnością przeciwutleniającą . W związku z tym, stosując nową procedurę, wyniki tych prac wykazały, że H. perforatum i P. ekstrakty harmala wykazują aktywność przeciwutleniającą związaną z hamowaniem MAO (niższa produkcja H2O2). Z drugiej strony, jednym z głównych ograniczeń w stosowaniu tych roślin jest ich potencjał do wytwarzania niepożądanych interakcji z innymi ziołami, żywności i leków . Hamowanie MAO-A może w pewnych okolicznościach wywoływać działania niepożądane .

4. Wnioski

ekstrakty z H. perforatum hamowały ludzkie MAO-A, a ekstrakty z kwiatów były najsilniejszymi inhibitorami. Były badane przez HPLC-DAD-MS i zawierały pseudohiperycynę, hiperycynę, hiperforynę, adhyperforynę, hiperfirynę i flawonoidy. Najwyższa zawartość tych związków pojawiła się w kwiatach. Hiperycyna była słabym inhibitorem MAO-A; hyperforina nie hamowała enzymu, a kwercetyna była umiarkowanym inhibitorem. Frakcja glikozydów kwercetyny i flawonoidów przyczyniła się do zahamowania MAO. Ekstrakty z nasion P. harmala silnie hamowały MAO-A, a ich siła hamowania była ponad tysiąc razy wyższa niż ekstraktów H. perforatum ze względu na zawartość alkaloidów harmaliny i harminy. L. ekstrakty z korzenia meyenii (maca) nie hamowały MAO-A. hamowanie MAO-a może nie wyjaśniać całego działania OUN przypisywanego H. perforatum, ale oczekuje się, że przyczyni się do tych działań w P. harmala. Rośliny te wywierają działanie przeciwutleniające. Dzięki zastosowaniu nowej metody praca ta udowodniła, że ekstrakty P. harmala i H. perforatum wykazują aktywność przeciwutleniającą związaną z hamowaniem MAO.

autorzy nie deklarują żadnych konkurencyjnych interesów finansowych.

podziękowania

autorzy są wdzięczni MINECO-FEDER (SAF2015-66690-R I SAF2015-68580-C2-R) i CSIC (Hiszpania) (projekt 200470e658) za wsparcie tej pracy. Autorzy są również wdzięczni Martie Aguilar Preiss za pomoc techniczną i Dr. V. Aránowi za pomoc w identyfikacji i selekcji roślin.