Antivenom Efeitos de 1,2,3-Triazoles contra Bothrops jararaca e Lachesis muta Cobras

Resumo

venenos de Cobra são misturas complexas de proteínas de ambas as enzimas e nonenzymes, que são responsáveis pela produção de diversos efeitos biológicos. A invenomação humana por mordidas de cobra, particularmente as da família viperida, induz um quadro patofisiológico complexo caracterizado por mudanças espectaculares na hemostase e frequentemente hemorragia também é visto. O presente trabalho relata a capacidade de seis de uma série de 1,2,3-triazole de derivativos para inibir alguns efeitos farmacológicos causados pelos venenos de Bothrops jararaca e Lachesis muta. Os ensaios in vitro demonstraram que estes compostos estavam comprometidos de forma dependente da concentração, o fibrinogénio ou a coagulação plasmática, hemólise e proteólise produzidas por ambas as venomas. Além disso, estes compostos inibiram os efeitos biológicos in vivo também. Os ratos tratados com estes compostos estavam totalmente protegidos das lesões hemorrágicas causadas por tais venoms. Mas só o B. a actividade indutora de edema de jararaca foi neutralizada pelos triazóis. Assim, o efeito inibitório dos triazoles derivativos contra alguns in vitro e in vivo biológica ensaios de soros antiveneno de cobra aponta para aspectos promissores que podem indicá-los como modelos moleculares para melhorar a produção de efetivo antivenom ou complementar o antivenom neutralização, especialmente o local patológico efeitos, que são parcialmente neutralizado por antivenoms.

1. Introdução

venenos de Cobra são misturas complexas de proteínas, incluindo enzimas metaloproteinases, serina, proteinases, phospholipases A2, e L-aminoácido oxidase) e proteínas sem atividade enzimática, tais como disintegrins, C-tipo de lectins, cysteine-rich secretoras de proteínas (CRISP) toxinas, peptídeos natriuréticos, e myotoxins. Os víboras venenosas Bothrops jararaca e Lachesis muta são responsáveis por acidentes envolvendo humanos em várias regiões da América do Sul. Pode ser encontrada nos seguintes países: Brasil, Paraguai e Argentina. muta é distribuída nas florestas equatoriais a leste dos Andes, que vão desde o leste do Equador, Colômbia, Peru, Norte da Bolívia e leste e norte da Venezuela, até Guiana, Guiana Francesa, Suriname e norte do Brasil. Dentro de seu alcance, eles são muitas vezes abundantes e são importantes causa de mordidas de cobra . O Envenoming destas cobras é caracterizado principalmente por sangramento sistêmico (hemorragia generalizada, coagulopatia, insuficiência renal e choque) e efeitos locais (hemorragia, edema e necrose) . Como relatado em outros lugares, as mordidas de cobra constituem um problema de saúde pública na América Latina e em outros países tropicais e subtropicais, nos quais são consideradas como uma questão de saúde negligenciada, de acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS) . Na América do Sul, B. jararaca induz uma maior incidência de mordidas (95%) do que L. muta (cerca de 2%); No entanto, as mordidas de L. muta geralmente levam a sintomas mais graves e sua incidência de letalidade é três vezes maior do que b. jararaca . Hoje em dia, a administração parentérica de antiveneno derivado de animais é o único tratamento específico para o endenoming por snakebites. No Brasil, a administração intravenosa de Bothrops polivalente antivenom é usado para tratar o envenoming casos causados por Bothrops mordidas ou o polivalente bothropic-lachetic soro de L. muta e Bothrops (B. atrox) picadas de cobra na Amazônia regiões. Como mencionado acima, endenomas moderados a graves infligidos por cobras Bothrops e Lachesis são caracterizados por uma série complexa de alterações locais e sistêmicas, tais como hemorragia, mionecrose, coagulopatia, choque cardiovascular, insuficiência renal e, eventualmente, morte . Como relatado por outros autores, apesar de ser Seguro, altas doses de Antivenenos às vezes utilizados no Brasil para tratar pacientes com afloramento de Bothrops/Lachesis comprovado ou suspeito pode contribuir para reações do tipo anafiláctico precoce e tardio (doença do soro). Assim, a produção de Antivenenos de qualidade adequada apresenta um desafio considerável. Além disso, os preços dos Antivenenos aumentaram e alguns países pararam o seu fabrico . Alguns Antivenenos eficientemente neutralizar os efeitos tóxicos sistêmicos do veneno; no entanto, os efeitos locais não são bloqueados e esta situação pode levar à amputação ou deficiência .

devido a esses problemas, tratamentos alternativos foram procurados e alguns deles envolveram a busca de novas moléculas capazes de neutralizar efeitos sistémicos e locais de venenos. Extratos de plantas e outras fontes naturais (como os de organismos marinhos) foram testados para a sua capacidade de neutralizar uma variedade de efeitos biológicos e tóxicos de venoms de cobras. Várias moléculas farmacologicamente ativas foram identificadas , e muitos efeitos já foram listados para eles, incluindo a sua capacidade antiveneno . Hoje em dia, muitas novas abordagens de bioprospecção estão sendo investigadas. No entanto, em conexão com isso, deve-se notar que os efeitos biológicos das moléculas derivadas da síntese orgânica ainda não foram bem explorados. A literatura tem descrito 1,2,3-triazole composto como uma classe importante de cinco membros heterocíclicos de azoto sistema que apresenta diferentes perfis farmacológicos, tais como antiplaquetários atividade anticoagulante , antiviral , trypanocidal , antimicrobiana , e/ou a sua utilização no tratamento da esquizofrenia e leishmaniose . Existem dois métodos gerais para a construção de anéis de 1,2,3-triazole: reações de cicloadição de huisgen 1,3-dipolar , em particular a cicloadição catalizada de cobre(i), e a eletrociclização intramolecular 1,5-de compostos β-substituídos-α-diazocarbonil . Os nossos estudos anteriores indicaram que seis novos compostos sintéticos de 1,2,3-triazole (1-arilsulfonilamino-5-metil-1H–ésteres etílicos do ácido triazole-4-carboxílico) inibiram a hemólise induzida pelo veneno de L. muta . De facto, estes derivados apresentavam uma vasta gama de actividades farmacológicas .

o objectivo deste trabalho foi avaliar a capacidade destes seis derivados 1,2,3-triazole com base em –1-(p-clorofenil)-1H–triazole-4-carboidrazida contra as actividades in vivo e in vitro de venenos de Bothrops jararaca e Lachesis muta.

2. Material

2.1. Venom e Material

Bothrops jararaca, Lachesis muta liofilizado venenos, e anti-Lachesis ou anti-Bothropic antivenom foram fornecidos pela Fundação Ezequiel Dias, Belo Horizonte, MG, Brasil, e armazenadas a -20°C até ensaios. Dimetilsufóxido (DMSO), fibrinogénio bovino e azocaseína foram obtidos da Sigma Chemical Co. Todos os outros reagentes eram da melhor qualidade disponível.

2.2. Os derivados sintéticos

os seis ésteres etílicos do ácido 1-arilsulfonilamino-5-metil-1H–triazole-4-carboxílico foram sintetizados de acordo com o nosso relatório anterior e as suas estruturas químicas são apresentadas na Figura 1. Estes compostos foram dissolvidos em dimetilsufóxido (DMSO) e armazenados a 4°C, até serem necessários.

Figura 1

estruturas Químicas dos seis 1,2,3-triazoles derivados N’–1-(p-clorofenil)-1H–triazole-4-carbohydrazide. Os seis derivados foram projetados como números, como mostrado no parêntesis após cada derivada.

2.3. Animais

BALB / c mice (18-20 g) foram obtidos do Núcleo de Animais de Laboratório (NAL) da Universidade Federal Fluminense. Os animais foram alojados em condições controladas de temperatura (°C) e luz. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Ética em experimentação Animal da UFF (protocolo número 297) que estavam de acordo com as diretrizes do Comitê Brasileiro de experimentação Animal (COBEA) e as leis e políticas internacionais.

3. Métodos

3.1. Inibição da hemólise indirecta

o grau de hemólise causado pelas venoms de L. muta e B. jararaca foi determinado pelo teste hemolítico indirecto utilizando eritrócitos humanos e emulsão de gema de ovo de galinha como substrato . A quantidade de L. muta e B. o veneno de jararaca (µg/mL) que produziu hemólise a 100% foi designado Como dose hemolítica mínima indirecta (DMI). Os experimentos inibitórios foram realizados incubando derivados triazólicos com um MIHD por 30 minutos à temperatura ambiente, e então, a atividade hemolítica foi avaliada. Os experimentos de controle foram feitos incubando venoms com DMSO ou solução salina.

3.2. Actividade anticoagulante

a actividade de coagulação de L. muta e B. jararaca venoms foi determinada utilizando um coagulómetro Amelung digital, modelo KC4A (Labcon, Alemanha). Diferentes concentrações de L. o veneno de muta (10 µg/mL) e de B. jararaca (40 µg/mL) foi misturado com solução de fibrinogénio bovino (2 mg/mL) ou com plasma humano, e a quantidade de veneno que coagulou quer fibrinogénio quer plasma em 60 segundos foi indicada como dose coagulante mínima (MCD). Para avaliar o seu efeito inibitório, os derivados do triazole foram incubados durante 30 minutos à temperatura ambiente com uma MCD de venenos, tendo a mistura sido adicionada ao fibrinogénio ou plasma e registado o tempo de coagulação. Experimentos de controle foram realizados em paralelo, adicionando DMSO ou solução salina incubada com venenos, em vez dos triazóis.

3.3. Actividade antiproteolítica

actividade proteolítica de venoms de L. muta e B. jararaca foi determinada utilizando azocaseína como substrato (0, 2% P/v, em Tris-HCl de 20 mM, CaCl2 de 8 mM, pH 8, 8), com pequenas modificações . Uma concentração efetiva (CE) foi definida como a quantidade de veneno (µg/mL) capaz de produzir uma variação de 420 nm de cerca de 0,2. Os derivados do Triazole foram incubados com um CE de veneno durante 30 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, a proteólise foi medida. Os experimentos de controle foram feitos incubando venoms com DMSO ou solução salina.

3.4. Actividade anti-hemorrágica

lesões hemorrágicas produzidas por L. muta e B. jararaca venoms foram quantificadas utilizando um procedimento descrito por Kondo et al. , com modificações. Brevemente, as amostras foram injectadas por via intradérmica (I. D.) na pele abdominal de ratos. Duas horas depois, os animais foram eutanasiados por decapitação, pele abdominal removida, esticada e inspecionada para mudanças visuais no aspecto interno, a fim de localizar manchas hemorrágicas. A hemorragia foi quantificada como a dose hemorrágica mínima (MHD), definida como a quantidade de veneno (mg/kg) capaz de produzir uma auréola hemorrágica de 10 mm . O efeito inibitório dos derivados do triazole foi investigado incubando compostos com duas MHD de veneno de L. muta ou B. jararaca durante 30 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, a mistura foi injetada em ratos e hemorragia foi medida. A atividade hemorrágica foi expressa como o diâmetro médio (em milímetro) do halo hemorrágico induzido por venenos na ausência e presença dos derivados do triazole. Testes de controle negativo foram realizados por injeção de DMSO ou solução salina.

3.5. Actividade antiedematogénica

actividade indutora de Edema de L. muta e B. jararaca venoms foi determinada de acordo com Yamakawa et al. , com modificações. Os grupos de cinco ratos foram injectados por via subcutânea (S. c) na base do pé direito com 50 µL de veneno, enquanto a base alimentar esquerda recebeu 50 µL de solução salina. Uma hora após a injecção, o edema foi avaliado e expresso como a percentagem de aumento no peso da base direita em comparação com a esquerda. O efeito inibitório dos derivados do triazole foi investigado incubando compostos com veneno de L. muta ou B. jararaca durante 30 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, a mistura foi injectada em ratos (pé direito) e o edema foi medido.

3.6. A análise estatística

os resultados são expressos em meios ± SEM obtidos com o número indicado de animais ou experiências realizadas. A significância estatística das diferenças entre grupos experimentais foi avaliada usando o teste do Estudante. Um valor ≤ 0, 05 foi considerado significativo.

4. Resultados e discussão

o desenvolvimento de Antivenenos eficazes, seguros, mais baratos e mais acessíveis merece atenção, uma vez que mordidas de cobra podem causar graves deficiências e matar milhares de pessoas também. Um número crescente de estudos têm sido focados na busca de inibidores de venenos de cobras de uma variedade de fontes, sejam elas naturais ou sintéticas . Benzoato de suramina e fenilo benzoílo são moléculas sintéticas capazes de inibir a miotoxicidade, a coagulação, e as atividades da fosfolipase A2 e da hialuronidase de venoms de cobras de diferentes famílias. Os análogos da lactona foram sintetizados e inibidos da miotoxicidade, e as actividades indutoras de edema e enzimáticas induzidas por uma fosfolipase A2 isolada de B. jararacussu também . Por outro lado, os princípios bioactivos marinhos também atraíram a atenção devido à sua ampla difusão de acções farmacológicas .

neste trabalho, foi avaliada a capacidade de seis 1-arylsulfonylamino-5-metil-1H–triazole-4-carboxílico ácido etil ésteres de neutralizar alguns in vitro (hemólise, coagulação, e proteólise) e in vivo (hemorragia e edema de indução) atividades causada por B. jararaca e L. Muta venoms, desde resultados anteriores indicaram que estes seis derivados inibiram a hemólise induzida pelo veneno de L. muta, mas com diferentes potências . Por esta razão, pensou-se que valeria a pena investigar as ações de tais derivados sobre outras atividades biológicas importantes relacionadas com mordidas de cobra, como proteólise, coagulação, hemólise, hemorragia e edema. Foi demonstrado que estes compostos inibiram a hemólise causada pelo veneno de B. jararaca (50 µg/mL) e L. muta (15 µg/mL) [Figura 2 a)]. A percentagem inibitória dos derivados foi superior a 50% em relação a ambas as venoms. No entanto, observou-se uma ligeira diferença no perfil inibitório para o derivado 6, em que se obteve uma inibição de 50% e 90% sobre hemólise para o veneno de B. jararaca e L. muta, respectivamente. Nem derivados nem DMSO levaram os eritrócitos à hemólise, nem DMSO interferiu no grau de hemólise causada por venenos.

(a)

b)

(a)
b)

Figura 2

o Efeito dos derivados sobre hemólise e proteólise. Os derivados 1-6 (45 µM) foram incubados com B. jararaca (colunas escuras) ou com L. muta (colunas tracejadas) durante 30 minutos à temperatura ambiente, e então foram realizadas atividades hemolíticas (a) e proteolíticas (b). Os dados são expressos como a média ± SEM de experiências individuais ().

a Endenomação por estes snakebites produz hemorragia grave devido ao elevado teor de metaloproteína dependente do zinco ou protease serina que digere componentes proteicos da matriz extracelular ou consome factores de coagulação sanguínea . B. jararaca and L. azocaseína hidrolisada com veneno de muta de forma dependente da concentração, com uma CE de 20 µg/mL e 6 µg/mL, respectivamente (dados não apresentados). Os derivados inibiram a proteólise induzida por B. jararaca ou L. muta [Figura 2(b)]. Os derivados 1, 2, 3 e 6 inibiram a proteólise induzida por ambas as venoms até 80% e o derivado 5 inibiu tal actividade abaixo de 50%. Observou-se uma diferença acentuada no perfil inibitório dos derivados para o derivado 4, no qual inibiu 97% e 25% da proteólise induzida por B. jararaca ou veneno de L. muta, respectivamente [Figura 2 (b)].

tal como se vê na Figura 3, derivados 1, 2, 4, 5 e 6, mas não o derivado 3 inibido de forma dependente da concentração (23-94 µM), a coagulação do fibrinogénio induzida pelas venomas de B. jararaca (40 µg/mL) ou L. muta (10 µg/mL). Parecia que os derivados inibiam mais eficientemente a coagulação de L. muta do que b. jararaca. Na concentração mais elevada (94 µM), os derivados 1, 2, 3, 5 e 6 impediram a coagulação de L. muta [Figura 3 (B)], enquanto os derivados 2 e 6 impediram o B. jararaca uma vez [Figura 3(b)]. Em concentrações até 200 µM, todos os derivados de 1,2,3-triazole efetivamente impediram a coagulação do fibrinogénio causada por ambas as venomas, mas em concentrações inferiores a 10 µM, nenhum destes compostos impediu a coagulação. No entanto, quando os derivados (10 µM) foram colocados todos juntos e incubados com veneno de B. jararaca ou l. muta, o tempo de coagulação foi atrasado duas vezes. Verificou-se que, se o derivado 2 ou 6 foi removido da mistura, não foi observado efeito inibitório sobre a coagulação. Além disso, os derivados também impediram a coagulação induzida por venomas quando o plasma foi utilizado. Nem o DMSO (1% v/v, concentração final) nem a solução salina interferiram nos processos de coagulação.

(a)

b)

(a)
b)

Figura 3

Efeito dos derivativos na coagulação do fibrinogênio. Os derivados de vinte e três µM (colunas cinzentas), 46 µM (colunas brancas) ou 94 µM (colunas pretas) foram incubados com 40 µg/mL de B. jararaca (a) ou com 10 µg/mL de L. muta (B) durante 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicionou-se mistura ao fibrinogénio (2 mg/mL) e registou-se o tempo de coagulação. As venosas foram incubadas com solução salina (C1); 1% v/v DMSO (C2); derivado 1 (coluna 1); derivado 2 (coluna 2); derivado 3 (coluna 3); derivado 4 (coluna 4); derivado 5 (coluna 5); e com derivado 6 (coluna 6). # significa que o fibrinogênio não coagular até 600 segundos de observação. Os dados são expressos como a média ± SEM de experiências individuais ().

a injecção intradérmica de veneno de B. jararaca (12 mg/Kg) ou l. muta (20 mg/Kg) produziu uma auréola hemorrágica de 20 mm em ratinhos. Tal halo representa dois MHD de venoms. Quando cada veneno foi misturado com derivados (90 µM) e, em seguida, injetado em ratos, uma proteção completa da hemorragia foi visto (dados não mostrados). Em contraste, resultados anteriores mostraram que o soro antilaquético não inibiu a hemorragia induzida pelo veneno de L. muta . A injeção de DMSO, derivados ou solução salina não produziu hemorragia. Indutor de Edema é outro efeito importante que segue a mordida da cobra . A figura 4 mostra que o edema induzido por 5 mg/Kg de B. jararaca(Figura 4 (A)) ou 8 mg / Kg L. muta(Figura 4 b)) foi significativamente reduzida pelos derivados (90 µM). Os derivados do triazole 1, 2 e 4 inibiram acima de 80% o edema induzido por B. jararaca, enquanto os derivados 3, 5 e 6 inibiram cerca de 70% [Figura 4 a)]. Como se viu, todos os derivados inibiram menos a actividade edematogénica induzida por L. muta [Figura 4 (b)].

(a)

b)

(a)
b)

Figura 4

o Efeito dos derivados sobre o edema de indução de atividade. Os derivados (90 µM) foram incubados com 5 mg/Kg de B. jararaca (a) ou com 8 mg/Kg de L. muta (B) durante 30 minutos à temperatura ambiente, e depois foi realizada a actividade indutora de edema. As colunas são derivadas 1 mais veneno( 1); derivado 2 mais veneno (2); derivado 3 mais veneno (3); derivado 4 mais veneno (4); derivado 5 mais veneno (5) e derivado 6 mais veneno (6). Os dados são expressos como a média ± SEM de experiências individuais ().

Em conclusão, 1-arylsulfonylamino-5-metil-1H–triazole-4-carboxílico ácido etil ésteres derivados podem ser úteis como protótipos para a concepção de novas moléculas para melhorar o tratamento atual usado para B. jararaca e L. muta picadas de cobra. A potência inibitória destes derivados pode variar ou ser aumentada quando foram colocados todos juntos, provavelmente agindo sinergisticamente. Assim, uma menor concentração deles seria necessária para alcançar uma neutralização completa dos efeitos biológicos causados por B. jararaca e L. muta venoms. Além disso, já se realizou uma análise prévia da relação estrutura-actividade dos derivados . Os derivativos foram submetidos à análise de “Lipinski a regra dos cinco”, que indica que um produto químico, molécula pode ser um activo por via oral da droga em seres humanos e como uma regra indica que uma molécula de violação de qualquer das seguintes regras é susceptível de ser pouco absorvido: (1) peso molecular menor que 500 Da, (2) número de doadores de ligação de hidrogênio (OH ou NH grupos) igual ou inferior a 5, (3) número de ligação de hidrogênio aceitantes inferior a 10, e, finalmente, (4) calculado menor que 5 . Os resultados mostraram que todos os derivados cumpriram esta regra (peso molecular = 296.31–341,30; 2.6–3.4; nHBA = 8-11 e nHBD = 1-3) apontando para uma boa biodisponibilidade teórica .Este trabalho foi apoiado pela Fundação Internacional para a Ciência (IFS Grant f/4571-1) e pelas seguintes agências de financiamento brasileiras: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro Carlos Chagas Filho (FAPERJ), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), and Universidade Federal Fluminense/Pró-reitoria de Pesquisa e Pós-graduação e Inovação (UFF/PROPPi).