Molecular Expressions microscopie Primer: tehnici de microscopie specializate-fluorescenta Galerie de imagini digitale-Madin-Darby Canine rinichi celule epiteliale (MDCK)

derivată de S. H. Madin și N. B. Darby din țesutul renal al unei femele adulte cocker spaniel, linia celulară MDCK își are originea în septembrie 1958. Din acel moment, celulele au fost utilizate pe scară largă pentru a investiga procesarea proteinei precursoare beta-amiloid, precum și sortarea produselor sale proteolitice.

morfologia liniei celulare MDCK este epitelială, iar celulele sunt pozitive pentru keratină prin colorarea imunoperoxidazei. Virusurile la care celulele MDCK sunt susceptibile includ stomatita veziculoasă (tulpina Indiana), vaccinia, coxsackievirus B5, reovirusul 2 și 3, adenovirusul 4 și 5, exantemul vezicular al porcinelor și hepatita canină infecțioasă. Celulele prezintă rezistență la coxsackievirus B3 și B4, precum și la poliovirus 2 și sunt negative pentru revers transcriptază.

linia MDCK este utilizată în mod obișnuit ca model general pentru celulele epiteliale, care cuprind tipul de țesut cunoscut sub numele de epiteliu. Găsit în principal acoperind organele interne și alte suprafețe ale corpului, epiteliul este format din celule bine ambalate care sunt organizate în foi. Aceste celule secretă o matrice extracelulară numită lamina bazală la baza lor, care ajută la ancorarea țesutului epitelial la țesuturile adiacente. Celulele epiteliale nu au, de asemenea, acces direct la vasele de sânge și, prin urmare, trebuie să obțină oxigen și substanțe nutritive prin difuzie, în același mod în care sunt forțate să scape de deșeurile metabolice. Epiteliile funcționează într-o varietate de mecanisme, inclusiv protecție, absorbție, recepție senzorială și secreție. Celulele epiteliale ale rinichilor joacă un rol-cheie în depozitarea temporară și secreția ulterioară a materialelor excretoare.

cultura celulelor renale Canine Madin-Darby prezentată în imaginea digitală de mai sus a fost etichetată cu Dapi și Alexa Fluor 568 conjugate cu faloidină, care vizează ADN-ul din nucleul celular și, respectiv, rețeaua citoscheletică A F-actinei. În plus, celulele au fost transfectate cu un vector de localizare subcelulară plasmidă himerică peyfp-mitocondrie (proteină fluorescentă galbenă îmbunătățită). Imaginile au fost înregistrate în tonuri de gri cu un sistem de camere Qimaging Retiga Fast-EXi cuplat la un microscop Olympus BX-51 echipat cu blocuri optice cu filtru de fluorescență cu emisie de bandă furnizate de Omega Optical. În timpul etapei de procesare, canalele individuale de imagine au fost pseudocolorate cu valori RGB corespunzătoare fiecărui profil spectral de emisie fluoroforă.

celulele epiteliale MDCK cu Cmxros roșu MitoTracker, Alexa Fluor 488 și Dapi – o cultură aderentă a celulelor renale Canine Madin-Darby a fost etichetată pentru rețeaua mitocondrială intracelulară și pentru actina filamentoasă cu Cmxros roșu MitoTracker și, respectiv, Alexa Fluor 488 conjugate cu faloidină. Sonda absorbantă de ultraviolete DAPI a fost utilizată pentru a contracara ADN-ul.

direcționarea peroxizomilor și proteinelor Clatrinei în celulele renale Madin-Darby cu imunofluorescență – în această secțiune, cultura prezentată a celulelor MDCK a fost marcată imunofluorescent cu anticorpi monoclonali primari anti-clatrin (lanț greu) de șoarece, urmată de fragmente fab anti-șoarece de capră conjugate cu colorantul Cianinic Cy3 pentru a viza rețeaua citoscheletică. În plus, peroxizomii prezenți în cultură au fost marcați imunofluorescent cu Cy2 conjugat cu anticorpi secundari de capră direcționați împotriva anticorpilor primari anti-PMP 70 de iepure (proteina membranei peroxisomale 70). Nucleele au fost contracarate cu Hoechst 33342.

proteină galbenă îmbunătățită localizarea Subcelulară a mitocondriilor în culturile celulare MDCK – o cultură a celulelor epiteliale renale Canine Madin-Darby a fost transfectată cu un vector de localizare subcelulară plasmidă himerică pEYFP-mitocondriile (proteină fluorescentă galbenă îmbunătățită). Celulele au fost, de asemenea, colorate cu Sytox Orange și Alexa Fluor 350 conjugate cu faloidină, vizând ADN-ul și, respectiv, rețeaua de actină filamentoasă citoscheletală.

țintirea imunofluorescenței histonelor și complexului Golgi în culturile de celule epiteliale renale Canine – celulele renale Canine Madin-Darby au fost fixate cu paraformaldehidă, permeabilizate și tratate cu un amestec de anticorpi primari de iepure (anti-giantin) și șoarece (anti-histone; pan), urmate de anticorpi secundari conjugați cu Alexa Fluor 488 și respectiv Texas Red. Cocktailul de anticorpi secundari conținea, de asemenea, Alexa Fluor 350 conjugat cu faloidină, conceput pentru a viza simultan rețeaua de actină filamentoasă.

imunofluorescența dublă a proteinelor complexe ale porilor nucleari și a joncțiunilor strânse în celulele renale Canine Madin-Darby – joncțiunile strânse ale celulelor epiteliale și proteinele complexe ale porilor nucleari au fost imaginate simultan în celulele MDCK cu un cocktail de anticorpi primari anti-npcp de șoarece și iepure anti-zo-3, urmate de anticorpi secundari anti-șoarece și anti-iepure de capră conjugați cu Alexa Fluor 488 și, respectiv, Alexa Fluor 568.

rețeaua mitocondrială din celulele MDCK – o cultură monostrat aderentă a celulelor renale Canine Madin-Darby a fost marcată imunofluorescent cu anticorpi proteici primari anti-oxphos complex inhibitor V de șoarece, urmată de fragmente fab anti-șoarece de capră conjugate cu fluoresceină. Cultura a fost ulterior colorată cu Alexa Fluor 568 conjugat cu faloidină pentru a dezvălui detalii despre rețeaua de actină filamentoasă și DAPI pentru ADN în nucleu.

celulele MDCK cu aglutinină din germeni de grâu – lectine sunt o clasă specializată de proteine vegetale care se leagă de grupuri specifice de carbohidrați atașate la proteine sau care locuiesc în membranele celulare. Un membru proeminent al acestui grup, aglutinina din germeni de grâu este adesea folosită pentru localizarea complexului Golgi în experimentele de etichetare a fluorescenței. Cultura ilustrată în această secțiune a fost etichetată cu aglutinină din germeni de grâu conjugată cu Texas Red, precum și Alexa Fluor 488 conjugat cu faloidină și DAPI (direcționarea ADN-ului în nucleu).

direcționarea mitocondriilor cu proteine fluorescente în culturile de celule renale Canine – o cultură semi-confluentă a celulelor MDCK a fost transfectată tranzitoriu cu o himeră plasmidă care conține secvența de codificare pentru proteina fluorescentă galbenă îmbunătățită (EYFP) fuzionată cu secvența de direcționare mitocondrială din subunitatea VIII a citocromului C oxidazei umane. După fixare și permeabilizare, celulele au fost contracarate pentru actină filamentoasă cu Alexa Fluor 546 conjugat cu faloidină și pentru ADN cu colorantul specific nuclear, DAPI.

joncțiuni strânse în culturile de celule renale Canine Madin-Darby – proteina de joncțiune strânsă ZO-3 a fost vizualizată prin imunofluorescență într-o cultură confluentă a celulelor MDCK. Anticorpii anti-zo-3 de iepure care vizează proteina au fost etichetați cu fragmente secundare fab anti-iepure de capră conjugate cu colorantul cianinic, Cy3. Nucleele au fost contracarate cu fluoroforul DAPI specific ADN-ului.

culturi celulare aderente MDCK cu Texas Red, Alexa Fluor 488 și Alexa Fluor 350 – într-un experiment dublu de etichetare a imunofluorescenței, o cultură de celule MDCK a fost tratată cu un cocktail de anticorpi primari anti-histone de șoarece (pan) și anti-PMP 70 de iepure (proteină cu membrană peroxisomală). Proteinele țintă au fost ulterior vizualizate cu anticorpi secundari anti-șoarece și anti-iepure de capră conjugați cu Texas Red și, respectiv, Alexa Fluor 488. Rețeaua citoscheletică a actinei filamentoase a fost contracarată cu Alexa Fluor 350 conjugat cu faloidină.

modele clasice de colorare în celulele epiteliale ale rinichilor canini – combinația acum tradițională și populară de Cmxros roșu MitoTracker, Alexa Fluor 488 conjugat cu faloidină și Hoechst 33342 a fost utilizată pentru a tripla eticheta o cultură aderentă a celulelor MDCK. Rețineți rețeaua neobișnuită de actină filamentoasă și numărul mare de mitocondrii care înconjoară nucleele din aceste celule.

localizarea Subcelulară a mitocondriilor cu proteine fluorescente în celulele MDCK – după fixare și permeabilizare, cultura celulelor MDCK prezentate în această secțiune a fost marcată cu iodură de propidiu și Alexa Fluor 350 conjugat cu faloidină, care vizează ADN-ul și, respectiv, actina filamentoasă. În plus, celulele au fost mai întâi transfectate cu un vector de localizare subcelulară plasmidă peyfp-mitocondrie, localizând astfel o etichetă proteică fluorescentă galbenă în rețeaua mitocondrială intracelulară.

rețeaua extinsă de tubulină din celulele epiteliale renale Canine Madin-Darby – microtubuli au fost colorați folosind imunofluorescență prin tratarea unei culturi fixe și permeabilizate a celulelor MDCK cu anticorpi primari anti-alfa-tubulini de șoarece urmați de anticorpi anti-șoarece de capră conjugați cu Alexa Fluor 568. Nucleele au fost contracarate cu Sytox Green. Deși nu a fost imaginată în această secțiune, Cultura a fost, de asemenea, etichetată cu Alexa Fluor 350 conjugat cu faloidină.

vizualizarea simultană a Clatrinei, peroxizomilor și nucleelor în culturile de celule MDCK – cultura celulelor MDCK prezentată în această secțiune a fost marcată imunofluorescent cu anticorpi monoclonali primari anti-clatrin (lanț greu) de șoarece urmată de fragmente fab anti-șoarece de capră conjugate cu colorantul cianinic Cy3 pentru a viza rețeaua citoscheletică. În plus, peroxizomii prezenți în cultură au fost marcați imunofluorescent cu Cy2 conjugat cu anticorpi secundari de capră direcționați împotriva anticorpilor primari anti-PMP 70 de iepure (proteina membranei peroxisomale 70). Nucleele au fost contracarate cu Hoechst 33342.

rețeaua de filamente intermediare de Citokeratină în celulele epiteliale ale rinichilor canini – Citokeratina este o componentă comună și abundentă a rețelei de filamente intermediare în celulele epiteliale. Cultura aderentă din această secțiune a fost marcată imunofluorescent cu anticorpi primari anti-citokeratină (pan) de șoarece, urmată de anticorpi secundari anti-șoarece de capră conjugați cu Marina Blue. Mitocondriile au fost vizualizate cu Cmxros roșu MitoTracker, iar nucleele au fost colorate cu verde SYTOX.

celulele renale Canine Madin-Darby cu Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 și Hoechst 33258 – localizarea simultană a joncțiunilor strânse și a proteinelor complexe ale porilor nucleari (npcp) a fost efectuată cu un experiment dublu de imunofluorescență cu celule MDCK folosind anticorpi primari anti-npcp de șoarece și iepure anti-zo-3. Țintele subcelulare au fost vizualizate folosind anticorpi secundari anti-șoarece și anti-iepure de capră (IgG) conjugați cu Alexa Fluor 488 și, respectiv, Alexa Fluor 568. ADN-ul din nuclee a fost contracarat folosind Hoechst 33258.

etichetarea imunofluorescentă a rețelei mitocondriale în culturile celulare MDCK – celulele renale Canine Madin-Darby au fost marcate imunofluorescent cu anticorpi proteici anti-oxphos ai complexului v inhibitor primar de șoarece, urmate de fragmente fab anti-șoarece de capră conjugate cu fluoresceină. Cultura a fost ulterior colorată cu Alexa Fluor 568 conjugat cu faloidină pentru a dezvălui detalii despre rețeaua de actină filamentoasă și DAPI pentru ADN în nucleu.

MitoTracker Red CMXRos, Cy2 și Hoechst 33258 în celulele renale Canine Madin-Darby – o cultură aderentă fixă și permeabilizată a celulelor renale Canine Madin-Darby a fost marcată imunofluorescent cu anticorpi primari anti-citokeratină de șoarece, urmată de fragmente fab anti-șoarece de capră conjugate cu colorantul cianinic, Cy2. Înainte de fixare, Cultura a fost tratată timp de o oră cu MitoTracker Red CMXRos, iar după tratamentele cu anticorpi, nucleele au fost contracarate cu Hoechst 33258.

legarea lectinelor de complexul Golgi în culturile de celule epiteliale MDCK – pentru a vizualiza legarea lectinei de complexul Golgi în celulele MDCK, o cultură aderentă a fost tratată cu aglutinină din germeni de grâu conjugată cu verde Oregon. Celulele au fost ulterior contracarate cu Alexa Fluor 568 conjugat cu faloidină pentru a localiza rețeaua de actină filamentoasă și pata de acid nucleic DAPI pentru a eticheta ADN-ul din nucleu.

celulele MDCK aderente cu Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 și coloranții Hoechst 33342 – Alexa Fluor au fost utilizate pentru a vizualiza distribuția clatrinei și a proteinei membranei peroxisomale 70 (PMP 70) într-o cultură a celulelor epiteliale renale Canine Madin-Darby. După reacțiile de imunofluorescență, celulele au fost contracarate cu Hoechst 33342 pentru a dezvălui locația nucleelor.

celulele renale Canine Madin-Darby cu Cmxros roșu MitoTracker, Alexa Fluor 488 și Dapi – una dintre cele mai utile combinații fluorofore pentru vizualizarea detaliilor celulare interne include Cmxros roșu MitoTracker pentru a viza mitocondriile, Alexa Fluor 488 conjugat cu faloidină pentru rețeaua de actină filamentoasă și DAPI pentru localizarea nucleelor.

vizualizarea rețelelor Citoscheletice de microtubuli și actină în culturile celulare MDCK – pentru vizualizarea simultană a rețelelor de actină și tubulină în celulele MDCK, o cultură fixă și permeabilizată a fost tratată cu anticorpi primari anti-alfa-tubulină de șoarece, urmată de un cocktail de anticorpi secundari anti-șoarece de capră conjugați cu Alexa Fluor 568 amestecat împreună cu Alexa Fluor 350 conjugat cu faloidină. Nucleele au fost contracarate cu Sytox Green.

imunofluorescența dublă a proteinelor complexe ale porilor nucleari și a joncțiunilor strânse în celulele renale Canine Madin-Darby – joncțiunile strânse ale celulelor epiteliale și proteinele complexe ale porilor nucleari au fost imaginate simultan în celulele MDCK cu un cocktail de anticorpi primari anti-npcp de șoarece și iepure anti-zo-3, urmate de anticorpi secundari anti-șoarece și anti-iepure de capră conjugați cu Alexa Fluor 568 și, respectiv, Alexa Fluor 488. Nucleele au fost contracarate cu Hoechst 33258.

proximitatea nucleului și a complexului Golgi în culturile de celule MDCK monostrat – apropierea dintre complexul Golgi și nucleele din celulele renale Canine Madin-Darby a fost probată într-un experiment dublu de imunofluorescență cu anticorpi primari anti-npcp de șoarece (proteina complexului porilor nucleari) și anticorpi primari anti-giantin de iepure (complexul Golgi). Țintele de anticorpi au fost vizualizate cu anticorpi secundari de capră conjugați cu Alexa Fluor 568 și, respectiv, Alexa Fluor 488, în timp ce cadrul citoscheletal al actinei a fost etichetat cu Alexa Fluor 350 conjugat cu faloidină.