hydrofob interaktionskromatografi (HIC) är en av de mest använda metoderna för att separera och rena proteiner i sitt ursprungliga tillstånd. HIC visar sig också vara ganska användbart vid isolering av proteinkomplex och vid studier av proteinvikning och utveckling. Så, hur fungerar HIC? Vilka är principerna bakom denna teknik? För att förstå mekanismen bakom denna typ av kromatografi, här är några saker du definitivt behöver veta.
Hur fungerar HIC?
i ett nötskal separerar HIC (även känd som ’saltning ut’) proteinmolekyler med hjälp av egenskaperna hos hydrofobicitet. I denna metod appliceras proteiner innehållande både hydrofila och hydrofoba regioner på en HIC-kolonn under höga saltbuffertbetingelser.
saltet i bufferten (vanligtvis ammoniumsulfat) minskar solveringen av provlösliga ämnen och exponerar de hydrofoba regionerna längs proteinmolekylens yta. Detta underlättar adsorptionen av dessa hydrofoba regioner till de hydrofoba områdena på det fasta stödet och fäller ut (kristalliserar) proteiner ur lösningen.
Tänk på att när du utför denna typ av kromatografi ökar tillsatsen av lyotrofa salter den hydrofoba effekten och minskar antalet och volymen av enskilda hydrofoba håligheter samtidigt som saltkoncentrationen minskar kommer att resultera i desorption från det fasta stödet. Som sådan kan prov eluering underlättas genom minskande saltgradient. Milda organiska modifierare eller tvättmedel kan också tillsättas elueringsbufferten för att underlätta elueringsprocessen.
med hjälp av principerna för HIC kan du binda proteiner från vattenhaltiga lösningar i varierande grad beroende på strukturen hos ditt protein av intresse, saltkoncentration, pH, temperatur och organiska lösningsmedel som används.
Hydrofob Interaktionskromatografi: Avtäcka de underliggande teorierna
det finns tre huvudteorier som kan hjälpa till att förklara mekanismen bakom HIC – (1) saltningsteorin, (2) den termodynamiska teorin och (3) ytspänningen eller Van der Waals forces-teorin.
Saltningsteori
enligt saltningsteorin bildar de hydrofoba aminosyrorna skyddade hydrofoba områden vid vikning i vattenlösning medan de hydrofila aminosyrorna tillåter proteiner att binda med vätemolekylerna i vattnet. Som ett resultat ökar sannolikheten för att proteinet kommer att lösa upp i vatten om tillräckligt med hydrofila områden finns i proteinmolekylernas yta.
men vid tillsats av anti-chaotrofa salter (såsom ammoniumsulfat och natriumsulfat) i lösningen kommer några av vattenmolekylerna att interagera med saltjonerna istället för den laddade delen av proteinet. När protein-proteininteraktionerna i lösningen blir starkare än lösningsmedel-lösta interaktioner, reagerar proteinmolekylerna fritt med varandra – så att de kan aggregeras och så småningom fällas ut ur lösningen. Följaktligen minskar tillsatsen av salt i lösningen lösligheten hos olika proteiner i varierande utsträckning.
Termodynamikteori
denna teori säger att interaktionen mellan hydrofoba molekyler är en entropidriven process, baserad på termodynamikens andra lag. Den hydrofoba interaktionen mellan två eller flera icke-polära molekyler i en polär lösningsmedelslösning är en spontan process som styrs av en förändring i entropi. Sådana interaktioner kan emellertid ändras genom att reglera temperaturen eller genom att modifiera lösningsmedelspolariteten.
som sådan, när en icke-polär molekyl kommer i kontakt med ett polärt lösningsmedel såsom vatten, kommer det att öka ordningsgraden för lösningsmedelsmolekylerna som omger den hydrofoba molekylen. Så länge entalpi inte ökar signifikant kommer detta att ge en minskning av entropi och ge en övergripande positiv förändring i Gibbs-energin. Som sådan kommer upplösningen av en icke-polär molekyl i ett polärt lösningsmedel inte att ske spontant eftersom det inte är termodynamiskt gynnsamt.
men när du lägger två eller flera icke-polära molekyler i en polär miljö kommer de hydrofoba ytorna på makromolekylerna att döljas från den polära omgivningen och de hydrofoba molekylerna kommer att samlas spontant. De mycket strukturerade lösningsmedelsmolekylerna som omger den exponerade ytan av de hydrofoba molekylerna kommer att förskjutas mot huvuddelen av lösningsmedlet bestående av mindre strukturerade molekyler. Som en konsekvens ökar entropin medan Gibbs-energin minskar. Under sådana fall blir hydrofob interaktion en termodynamiskt gynnsam process.
Ytspänning, van der Waals teori
denna teori antyder att den hydrofoba interaktionen i HIC är beroende av van der Waals krafter mellan proteiner och immobiliserade ligander eftersom dessa krafter ökar när den ordnade strukturen av vatten ökar i närvaro av saltning av salter.