Karbamoylfosfatsyntas (CPSase) är ett heterodimeriskt enzym som består av en liten och en stor subenhet (med undantag av CPSase III, som består av en enda polypeptid som kan ha uppstått från genfusion av glutaminas-och syntetasdomänerna). CPSase har tre aktiva platser, en i den lilla underenheten och två i den stora underenheten. Den lilla subenheten innehåller glutaminbindningsstället och katalyserar hydrolysen av glutamin till glutamat och ammoniak, som i sin tur används av den stora kedjan för att syntetisera karbamoylfosfat. Den lilla underenheten har en 3-lagers beta / beta / alfa-struktur och tros vara mobil i de flesta proteiner som bär den. Den C-terminala domänen för den lilla subenheten av CPSase har glutaminamidotransferasaktivitet. Den stora subenheten har två homologa karboxifosfatdomäner, vilka båda har ATP-bindningsställen; emellertid katalyserar den N-terminala karboxifosfatdomänen fosforyleringen av bikarbonat, medan den C-terminala domänen katalyserar fosforyleringen av karbamatmellanprodukten. Karboxifosfatdomänen som hittades duplicerad i den stora subenheten av CPSase finns också som en enda kopia i de biotinberoende enzymerna acetyl-CoA-karboxylas (ACC), propionyl-CoA-karboxylas (PCCase), pyruvatkarboxylas (PC) och ureakarboxylas.
den stora subenheten i bakteriell CPSase har fyra strukturella domäner: karboxifosfatdomänen 1, oligomeriseringsdomänen, karbamoylfosfatdomänen 2 och allosterisk domän. CPSase heterodimerer från Escherichia coli innehåller två molekylära tunnlar: en ammoniaktunnel och en karbamattunnel. Dessa interdomäntunnlar förbinder de tre distinkta aktiva platserna och fungerar som ledningar för transport av instabila reaktionsmellanprodukter (ammoniak och karbamat) mellan successiva aktiva platser. Den katalytiska mekanismen för CPSase involverar diffusion av karbamat genom det inre av enzymet från syntesstället inom den stora subenhetens N-terminala domän till fosforyleringsstället inom den C-terminala domänen.